3.2 Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết n – hexane
3.2.1 Khảo sát thành phần định tính và lựa chọn dung môi
+ Triển khai sắc ký lớp mỏng: Lấy một lượng nhỏ cặn dịch chiết n – hexane của lá cây Bần giác hòa tan trong hỗn hợp EtOAc- Hexane . Pha hệ dung môi (2 mL) rồi đổ vào bình triển khai sắc ký. Sử dụng bản mỏng với kích thước 15 mm x 40 mm. Đưa chất lên lớp mỏng bằng ống mao quản, cách đáy bản mỏng 6 mm và cách đều hai bên mép bản, để dung môi bay hết rồi đưa vào bình triển khai. Khi dung môi chạy lên cách mép trên của bản khoảng 3 mm thì lấy bản mỏng ra, sấy để dung môi bay hết.
+ Lập sắc ký đồ: Tiến hành lập sắc ký đồ trong các điều kiện sau: Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng = 254 nm và 366 nm. Phun thuốc thử Ce(SO4)2, sấy bản mỏng, quan sát dưới ánh sáng thường.
Lá cây Bần giác (OEL; 971,61g) Dịch n-hexane Bã n-hexane 8L x 24h x 6 lần Cất quay dưới P giảm Cặn n-hexane OELH; 12g Dịch EtOAc Cất quay dưới P giảm Cặn EtOAc OELE; 20,14g Bã EtOAc 6L x 24h x 6 lần Dịch MeOH Cất quay dưới P giảm Cặn MeOH OELM; 71,97g Bã MeOH, 6L x 24h x 4 lần
Mỗi vết tách ra trên bản mỏng có một giá trị Rf khác nhau. Dựa trên sắc ký đồ, phân tích sơ bộ thành phần chiết để biết: Số lượng chất có trong cặn chiết, đánh giá sơ bộ khả năng phân tách chất của dung môi trên silica gel.
Các bản mỏng sau khi được triển khai sắc ký, hiện màu bằng đèn tử ngoại sau đó phun thuốc thử Ce(SO4)2 thu được kết quả tương ứng như sau (Hình 3.6):
Hình 3.6. Kết quả khảo sát TLC cặn chiết n – hexane lá cây Bần giác
Kết quả so sánh cho thấy các chất được khai triển tốt nhất ở hệ dung môi (V) và nhiều vệt chất hiện màu với thuốc thử Ce(SO4)2 và hiện UV ở các bước sóng = 254 nm, 366 nm.
Ce(SO4)2 UV-254 UV-366 EA/n-Hexane 20%
Hình 3.7. TLC cặn n – hexane lá cây Bần giác với hệ dung môi EA/n-hexane 20%
Do đó, lựa chọn hệ dung môi EA/n-hexane với độ phân cực tăng dần làm dung môi rửa giải cho cột tổng cặn n – hexane của lá cây Bần giác.
3.2.2 Quá trình phân lập các chất
Bước 1: Chuẩn bị cột
Sử dụng cột có đường kính 6 cm, chiều dài 50 cm được rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, lót dưới đáy một ít bông. Chuẩn bị cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt:
Cân 250 gam silica gel, ngâm trương nở ngập trong n-hexane khoảng 30 phút, trong quá trình ngâm dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí. Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 3h.
Bước 2: Đưa chất lên cột
12 gam cặn chiết n – hexane (kí hiệu OELH) được hòa với n – hexane vừa đủ cho tan hết, rồi đem trộn với khoảng 15 gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi trên máy quay cất chân không đến khi thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu đen. Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột (Hình 3.8).