2.2 HÓA CHẤT
2.2.1 Nguồn gốc, xuất xứ
Các loại hóa chất được sử dụng trong thực nghiệm có xuất xứ như sau
- D-(+)-glucoza 99,5%, enzyme glucose oxidase (GOx) và chitosan của hãng Sigma (Mỹ).
- KH2PO4, Na2HPO4, axit acetic, ethanol tinh khiết và glutaraldehyde, H2SO4 và H2O2 của hãng Merck (Đức).
- Keo epoxy Pioneer Plus Five Epoxy do hãng Republic Chemcal Inidustries, INC (Philipin) sản xuất được sử dụng để cách điện mối hàn. - Nước được dùng để pha các hóa chất trong thực nghiệm này là nước cất
hai lần.
2.2.2 Pha hóa chất
Các loại hóa chất được sử dụng như sau: dung dịch piranha để rửa điện cực, các dung dịch chitosan, glutaraldehyde và glucose oxidase để biến tính điện cực, dung dịch đệm photphat (PBS – phostphate buffer solution) là dung dịch nền để tạo môi trường có độ pH tương tự như máu người. Mỗi dung dịch được pha với các nồng độ và dung môi khác nhau, được trình bày cụ thể dưới đây.
Dung dịch piranha: pha hỗn hợp axit sulfuric (H2SO4) và hydrogen peroxide (H2O2) theo tỷ lệ thể tích 3:1. Đây là dung dịch có tính oxi hóa mạnh, được dùng để rửa các hợp chất hữu cơ bám trên điện cực.
Dung dịch đệm photphat (PBS): Pha hai dung dịch KH2PO4 và Na2HPO4
nồng độ 1/15 M theo tỷ lệ thể tích như trong bảng 2.1 để được 100 mL dung dịch đệm photphat nồng độ 1/15 M với độ pH là 7,0 (độ pH hoạt động tối ưu của enzyme) và 7,4 (độ pH của máu người).
Bảng 2.1: Tỷ lệ KH2PO4 và Na2HPO4để pha dung dịch PBS.
pH KH2PO4 1/1 5M
(mL) Na2HPO(mL) 4 1/15 M
7,0 38,8 61,2 7,4 18,2 81,8
Dung dịch enzyme glucose oxidase (GOx): được pha trong dung dịch PBS có
nồng độ và độ pH giống như dung dịch cần khảo sát, và được trữ trong tủ lạnh ở 4oC khi chưa sử dụng.
Dung dịch chitosan: Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, là một chất
rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ theo các kích cỡ khác nhau. Chitosan có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị, không tan trong nước, dung dịch kiềm và axít đậm đặc nhưng tan trong axit loãng (pH 6), tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy 309-311oC, trọng lượng phân tử trung bình khoảng 10.000-500.000 dalton tùy loại. Chính nhờ vào những đặc tính sinh học này mà chitosan được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y học, xử lý nước, công nghiệp nhuộm, giấy, mỹ phẩm, thực phẩm... Để pha 100 mL dung dịch chitosan, hòa tan 0,5 gam chitosan với 100 mL axit acetic nồng độ 10 mg/L và khuấy bằng máy khuấy từ cho đến khi tan hoàn toàn. Sau đó lọc bằng màng lọc kích thước 2 μm và được cất ở 4oC.
Dung dịch glutaraldehyde (GAD): được pha trong dung dịch PBS với nồng
độ 25%wt, và được trữ ở nhiệt độ phòng khi chưa sử dụng.
Dung dịch glucoza: Glucoza (C6H12O6) là một carbonhydrate có sáu nguyên tử carbon trong đó có một nguyên tử thuộc nhóm aldehyde, khối lượng phân tử là 180,16 g/mol. Ở trạng thái cân bằng, phân tử glucoza tồn tại ở hai dạng mạch thẳng và mạch vòng. Dạng mạch vòng được tạo thành do liên kết hóa trị giữa nguyên tử C
[6]. Trong dung dịch thì hai dạng mạch vòng và mạch thẳng tương đương nhau, nhưng trong môi trường pH 7,0 thì dạng mạch vòng là chủ yếu. Có hai dạng đồng phân hemiacetal đó là α-glucoza và β-glucoza. Tỷ lệ của hai đồng phân này trong dung dịch D-glucoza là 36:64.
Hình 2.7: Hai dạng đồng phân của glucoza.
Với α- và β-glucoza, nguyên tử hydro gắn với nguyên tử carbon C1 khá hoạt động do tính axit của nhóm OH trong dạng hemiacetal (pKa = 12,3) khá mạnh [18]. Trong đó, β-glucoza có độ hoạt động cao hơn do định hướng hình học của nguyên tử hydro gắn với nguyên tử C1.
Khi oxi hóa β-glucoza với xúc tác enzyme sẽ xảy ra phản ứng khử hydro tại vị trí C aldehyde (C1) tạo ra sản phẩm là gluconolactone theo phương trình
β-glucoza + O2 → Gluconolactone + H2O2
Để pha dung dịch glucoza, trước tiên pha 18 gam glucoza với 100 mL nước cất để được dung dịch glucose stock 1 M rồi ủ qua đêm ở 4oC để D-glucoza biến đổi hoàn toàn thành β-D-glucoza. Sau đó pha loãng dung dịch glucoza stock này với dung dịch PBS để được dung dịch glucoza có nồng độ mong muốn.
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trong phần thực nghiệm của luận văn, chúng tôi khảo sát đồng thời khả năng phát hiện glucoza của sợi nano Pt và màng mỏng Pt rồi so sánh kết quả. Quá trình thực nghiệm được tiến hành như sau:
- Khảo sát điện cực trước khi biến tính bằng kính hiển vi điện tử quét và kính hiển vi lực nguyên tử.
- Cố định enzyme lên điện cực sợi nano Pt và màng mỏng Pt. - Khảo sát điện cực sau khi biến tính bằng máy SEM và AFM. - Khảo sát khả năng phát hiện glucoza của sợi nano Pt.
2.3.1 Biến tính điện cực sợi nano và điện cực màng mỏng
2.3.1.1 Quy trình thực hiện
Để gắn enzyme lên điện cực, đầu tiên ta rửa điện cực với dung dịch piranha để loại bỏ các chất hữu cơ còn bám lại trên điện cực, đồng thời làm tăng tính ưa nước của điện cực. Sau đó biến tính điện cực theo hai quy trình khác nhau (hình 2.8), quy trình 1 sử dụng chitosan và glutaraldehyde làm lớp màng polymer gắn kết enzyme lên điện cực, quy trình 2 không sử dụng màng polymer mà enzyme chỉ đơn giản là được hấp phụ vật lý lên điện cực.