Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp điều tra thành phần và diễn biến mật độ nhện nhỏ hại trên đậu cove trên đậu cove
- Điều tra theo quy chuẩn 01-38: 2010/BNNPTNT về quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng. Tiến hành điều tra 1 tháng/ lần trên cây đậu cove. Điều tra tự do 10 điểm, mỗi điểm 10 lá ngẫu nhiên.
Tại mỗi điểm điều tra quan sát kỹ hai mặt lá của cây trồng, thu từng nhóm dịch hại riêng biệt để tiện cho việc xử lí mẫu.
• Tính toán số liệu: Mức độ phổ biến (%) = Số lá có nhện hại Tổng số lá điều tra × 100 >75% : rất phổ biến (++++) 50-75% : phổ biến (+++) 25-50% : it phổ biến (++) <25% : rất ít (+)
- Dựa vào việc điều tra thành phần nhện bắt mồi thu được. Tiến hành điều tra diễn biến mật độ 7 ngày/ lần trên cây đậu cove. Điều tra trên 10 điểm chéo góc, mỗi điểm lấy ngẫu nhiên 10 lá trên 5 cây liên tiếp khi cây còn non. Khi cây đã lớn mỗi điểm thu 10 lá (theo 3 tầng gồm lá non, lá bánh tẻ và là già) về phòng đếm toàn bộ số nhện di động dưới kính hiển vi soi nổi, trường hợp mật độ nhện quá cao, đếm ¼ lá rồi nhân 4.
Mật độ nhện được xác định dựa trên công thức: Mật độ (con/lá) = Tổng số nhện thu được
Tổng số lá điều tra
3.4.2. Phương pháp nuôi nguồn nhện vật mồi
• Nguồn nhện đỏ thu bắt từ ngoài đồng được đưa vào nuôi trên đĩa lá đậu. - Chuẩn bị đĩa lá: Lá bánh tẻ của cây đậu, được ngắt rồi đặt trên bông thấm nước trong hộp sao cho các mép lá nằm dính sát trên bông ẩm để tránh sự di chuyển khỏi lá của nhện. Bông được giữ ẩm bằng cách thêm nước, sao cho cuống lá có bông ẩm bao trùm, như vậy có thể giữ tươi vài ngày.
- Quá trình nuôi bắt nguồn từ việc dùng bút lông chuyển 30 - 40 con nhện cái trưởng thành nhện bắt mồi sang đĩa lá có nhiều trứng và các pha phát triển của nhện đỏ trong thời gian 2 giờ để cho chúng đẻ trứng. Đĩa lá được đặt trên bông ẩm trong hộp. Sau đó chuyển toàn bộ nhện cái ra ngoài chỉ để trứng phát triển, nhờ lột xác ta biết được nhện bắt mồi chuyển tuổi. Trước khi hóa trưởng thành ta thả vào 1 hoặc 2 nhện đực vào ghép đôi giao phối, quá trình theo dõi tiến hành ngày 2 lần, cứ 2 ngày thay lá 1 lần. Sau khi nhện bắt mồi đẻ trứng lần đầu tiên theo dõi mỗi ngày 1 lần cho tới khi nhện chết sinh lý. Hằng ngày chuyển số trứng nhện bắt mồi đẻ ngày hôm trước ra ngoài. Tránh ảnh hưởng của mật độ trứng tới quá trình sinh sản. Bằng cách đó hoàn toàn đáp ứng được môi trường ổn định và không hạn chế (Birch, 1948).
Hình 3.2. Khay nuôi nguồn nhện vật mồi
• Loài nhện hại kho Carpoglyphus lactic được PGS. TS. Nguyễn Đức Tùng – Bộ môn Côn trùng, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam cung cấp. Thức ăn cho nhện hại kho là cám gà úm C225, nuôi ở điều kiện phòng. Để đảm bảo đủ nguồn thức ăn nuôi nhện bắt mồi thì việc nhân nguồn nhện kho trước ngày nuôi sinh học 10 ngày. Phương pháp nuôi như sau:
Chuẩn bị dụng cụ: Sử dụng hộp nuôi là hộp nhựa cao 5,5cm, đường kính đáy 5cm, đường kính miệng 7cm có nắp đậy, đục lỗ ở nắp, dùng vải hoặc lưới che có kích thước lỗ nhỏ (dưới 0,2mm) đậy lại, dán băng dính hai mặt để tránh loài khác xâm nhập hoặc nhện nuôi bò ra ngoài.
Cho cám C225 vào hộp nuôi, khối lượng cám 3 gam.
Dùng bút lông chuyển đưa từ 50–100 con mỗi loài vào các hộp nuôi, đậy nắp, đảm bảo cách ly.
* Cách ly nguồn nhện
Để đảm bảo nguồn nhện hại kho không bị lẫn các loài nhện khác hay bất kỳ loại côn trùng nào khác cần tiến hành cách ly. Quy trình cách ly như sau:
- Phạm vi: Phòng thí nghiệm - Dụng cụ:
+ Hộp nhựa có nắp (a) kích thước 16 × 26 × 9cm và (b)12 × 17 × 8cm + Khay đựng loại to kích thước (c) 33 × 45 × 15cm
+ Nắp của các hộp được cắt khoảng 1/3 nắp tùy theo kích thước hộp sau đó dán lại bằng vải.
* Các bước tiến hành:
Bước 1: Vệ sinh nơi đặt hộp nuôi nhện: Vệ sinh bằng nước nóng 1000C, đun sôi nước, sau đó rửa nơi đặt nhện, để khô rồi lau lại bằng cồn, sau 1 giờ kiểm tra bằng mắt xem còn nhện hay không, trong trường hợp thấy có nhện cần vệ sinh lại một lần nữa.
Bước 2: Đặt hộp nuôi nhện (hộp nhựa cao 5,5cm, đường kính đáy 5cm, đường kính miệng 7cm) vào trong hộp có nắp (a) có nước, mực nước 1cm, rồi đậy lại.
Bước 3: Tiếp theo đặt hộp (a) vào hộp (b) có nước cao khoảng 2–4cm rồi đậy nắp.
Bước 4: Đặt hộp vào khay (c) có nước cao 2–4cm.
3.4.3. Phương pháp nuôi nguồn nhện bắt mồi
• Nguồn nhện bắt mồi N. californicus được cung cấp bởi PGS. TS. Nguyễn Đức Tùng. Nhện bắt mồi được nuôi bằng nguồn nhện đỏ hai chấm và được nuôi trên lá đậu.
Lá đậu sạch được đặt trên một tấm mút dày 1cm đặt trong khay nhựa trong kích thước 20x13x5 cm chứa nước. Các cạnh của khay nhựa, lá được phủ bởi các băng giấy ăn nhằm cung cấp nước uống cho nhện bắt mồi và ngăn nhện bắt mồi chạy trốn. Thả nhện đỏ hai chấm làm thức ăn cho nhện bắt mồi. Chuyển nguồn nhện sang hộp nguồn mới nếu đĩa lá bị nát,thối hỏng hoặc bề mặt hộp nguồn bị ướt.
• Nguồn nhện bắt mồi A. largoensis được nuôi trên tấm nhựa xanh kích thước (10 × 10 × 0,3cm) (Multicel, SEDPA, Pháp) đặt trên một tấm mút dày 1cm đặt trong hộp nhựa trong kích thước 17 × 11 × 5cm chứa nước. Các cạnh của tấm nhựa được phủ bởi các băng giấy ăn nhằm cung cấp nước uống cho NBM và ngăn NBM chạy trốn. Một sợi chỉ đen nhỏ được cho vào ô nuôi để làm giá thể cho NBM đẻ trứng. Hai ngày một lần trứng được thu và chuyển sang hộp nuôi mới. Sử dụng nhện kho C. lactis để làm thức ăn cho nhện bắt mồi.
• Nhân nuôi nhện bắt mồi N. longispinosus tương tự các bước nhân nuôi loài NBM A. largoensis
Hình 3.3. Hộp và khay nuôi nguồn nhện bắt mồi
3.4.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học NBM
Nghiên cứu đặc điểm sinh học nhện bắt mồi được thực hiện với phương pháp nuôi cá thể trong lông mica Munger cải tiến theo mô tả của Nguyen & cs. 2013. Lồng Munger (cải tiến) gồm 6 lớp có kích thước 4cm × 4cm.
- Lớp trên cùng là màng phim trong, dày 0,15 cm, ở giữa được khoét lỗ với đường kính 2,2cm.
- Lớp thứ 2 là tấm bóng kính ở giữa dùng kim côn trùng loại 00 châm 15 lỗ để cho không khí lưu thông.
- Lớp thứ 3 là tấm mica đen với kích thước dày 0,3cm, ở giữa được khoét lỗ tạo nên khoang nuôi với đường kính 2,0cm.
- Lớp thứ 4 là miếng lá đậu cô ve để làm thức ăn cho nhện đỏ hai chấm, miếng lá thường lấy phía cuối lá, tránh lấy phần gân lá to.
- Lớp thứ 5 gồm 2-3 lớp giấy thấm ẩm. - Lớp cuối cùng là tấm mica đen dày 0,2m.
Các lớp được cố định hai bên bằng kẹp đen 25cm.
Trước khi thí nghiệm 8 giờ đặt một đoạn chỉ màu đen vào đảo nuôi NBM. Sau 8 giờ nhấc chỉ để thu trứng NBM dính vào sợi chỉ, rồi chuyển từng trứng vào trong lồng Munger có sẵn từ 5 trưởng thành cái của 1 loài nhện hại cây trồng. Đặt các lồng như vậy thành từng hàng lên khay thí nghiệm, đặt các khay thí nghiệm trong 1 hộp kín (kích thước 40 × 30 × 15cm) phía dưới có dung dịch muối bão hòa để cố định ẩm độ tương đối. Hàng ngày theo dõi dưới kính lúp 1 lần để xác định trứng nở, sự chuyển tuổi nhờ xác lột, tỷ lệ sống sót, đồng thời bổ sung nhện hại làm thức ăn. Sau 3 ngày thay lồng nuôi mới. Khi NBM chuyển sang tuổi 3 thì đưa một nhện đực và một nhện cái cùng ngày tuổi vào cho ghép đôi. Hàng ngày chuyển hết toàn bộ trứng được đẻ trong ngày ra ngoài lồng để tránh ảnh hưởng của mật độ trứng đến sức sinh sản của NBM và từng trứng sẽ được nuôi riêng rẽ mỗi trứng trong 1 lồng nuôi cho đến khi con cái thế hệ sau đã được ghép cặp đẻ quả trứng đầu tiên.Chỉ tiêu theo dõi là ngày trứng nở, ngày lột xác, ngày đẻ quả trứng đầu tiên, số trứng đẻ trong từng ngày, ngày chết sinh lý…
Hình 3.4. Lồng mika, tủ định ôn, khay dùng để nuôi sinh học NBM
3.4.5. Phương pháp đo kích thước nhện bắt mồi
Các pha nhện bắt mồi được chụp bằng kính hiển vi soi nổi và được xác định kích thước bằng phần mềm Axio Vision Rel 4.8.
3.4.6. Phương pháp đánh giá sức ăn của NBM
NBM trưởng thành cái được thả trên đĩa lá đậu sau khi cách ly cho nhịn đói 24h. Những lá đậu được cắt thành hình vuông có kích thước 2,5 × 2,5cm, đặt ngửa trên tấm mút ẩm xung quanh có viền bông ẩm. Trong đĩa lá đã có sẵn 40
trứng nhện đỏ (được đẻ trong 24h) hoặc 20 nhện non tuổi 1, tuổi 2, tuổi 3 hoặc trưởng thành cái nhện đỏ có kích thước đồng đều làm thức ăn cho nhện bắt mồi. Sau 24 giờ xác định số lượng trứng hoặc nhện non, nhện trưởng thành nhện đỏ hai chấm bị ăn, sau đó chuyển nhện bắt mồi sang đía lá mới có số lượng vật môi tương tự ngày thứ nhất để tiếp tục theo dõi sức ăn. Thí nghiệm được tiến hành với cả 3 loài nhện bắt mồi với số lần lặp ở mỗi công thức là 10.
3.4.7. Phương pháp xử lí và tính toán số liệu • Công thức tính tỷ lệ trứng nở, tỷ lệ cái: • Công thức tính tỷ lệ trứng nở, tỷ lệ cái:
- Công thức tính tỷ lệ trứng nở :
Tỉ lệ trứng nở(%) = Tổng số trứng nở
Tổng số trứng theo dõi × 100
- Công thức tính tỉ lệ cái:
Tỉ lệ cái(%)= Tổng số con cái
Tổng số con theo dõi×100
• Công thức xác định thời gian phát dục của một cá thể:
X =∑ Xini
N i=1
N
Trong đó: X: thời gian phát dục trung bình Xi: thời gian phát dục ở ngày thứ i ni : số cá thể phát dục ở ngày thứ i N: tổng số cá thể theo dõi
- Độ lệch chuẩn: ∆= S×tα
√n
Trong đó n: dung lượng mẫu; S: phương sai mẫu; tα: giá trị t-student
với α = n − 1.
• Phương pháp tính sức tăng quần thể:
Tỷ lệ tăng tự nhiên (rm) được tính dựa trên công thức của Birch (1948):
∑ 𝑙𝑥𝑚𝑥𝑒−𝑟𝑚∗𝑥 = 1
Trong đó: x là ngày tuổi của nhện cái (ngày), lx là tỷ lệ sống sót của nhện cái tại ngày tuổi x và mx là số lượng cá thể cái được nhện cái sinh ra tại ngày tuổi x. Giá trị mx được tính bằng cách nhân số lượng trứng đẻ trung bình của nhện cái với tỷ
lệ cái ở thế hệ sau tại ngày tuổi x của nhện cái. Phương pháp Jackknife của Meyer et al. (1986) và Hulting et al. (1990) được sử dụng để tính sai số chuẩn của giá trị rm. Các chỉ tiêu khác của sức tăng quần thể được tính theo Maia et al.
(2000) như tỷ lệ sinh sản thuần (R0) chỉ số lượng cá thể cái được sinh ra bởi một nhện cái (con cái/nhện cái):
R0 = ∑ lxmx
hay thời gian 1 thế hệ (T) là khoảng thời gian cần thiết để số lượng quần thể tăng Ro lần (ngày):
T = lnRo
rm
3.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Tất cả số liệu được xử lý thống kê bởi phần mềm SPSS phiên bản 20. Số liệu được kiểm tra phân bố chuẩn dựa trên kiểm định Kolmogorov–Smirnov. Khi số liệu không phải phân bố chuẩn kiểm định Kruskal Wallis được dùng để xác định sự sai khác giữa các loài nhện bắt mồi, khi có sự sai khác kiểm định Mann- Whitney U được tiến hành để xác định sự sai khác giữa từng cặp nhện bắt mồi. Trong trường hợp phân bố chuẩn, kiểm định One way ANOVA được sử dụng, sự sai khác được xác định dựa trên Tukey và Tamhane. Với so sánh tỷ lệ cái ở thế hệ thứ 2, Generalized linear model được sử dụng với số liệu được nhập theo dạng nhị phân, 1 ứng với cá thể cái và 0 ứng với cá thể đực. Trong tất cả các kiểm định giá trị P nhỏ hơn hoặc bằng 0,05 chứng tỏ sai khác có ý nghĩa.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. ĐIỀU TRA THÀNH PHẦN, DIỄN BIẾN NHỆN HẠI VÀ NHỆN BẮT MỒI TRÊN ĐẬU RAU TẠI VĂN ĐỨC - GIA LÂM VÀ VĂN GİANG - MỒI TRÊN ĐẬU RAU TẠI VĂN ĐỨC - GIA LÂM VÀ VĂN GİANG - HƯNG YÊN
Điều tra được tiến hành trên các ruộng tại Văn Đức, Gia Lâm và Văn Giang, Hưng Yên từ khi cây được 2-3 lá cho đến khi cây già và chết đi với các giống đậu cove và đậu đũa được canh tác bởi các phương pháp khác nhau : phương pháp truyền thống và theo tiêu chuẩn VietGap (được mô tả trong phụ lục). Trong thời gian điều tra thời tiết tháng 4 và tháng 5 nắng nóng, mưa xuất hiện vào giữa tháng tư khi cây leo giàn và bắt đầu ra hoa. Theo phỏng vấn thì có 3 loại thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng trong phòng chống nhện đỏ là Ortus 5SC, Pegasus 500SC, Comite 73EC; các loại thuốc này kết hợp một số loại thuốc bảo vệ thực vật khác được sử dụng chủ yếu vào giai đoạn cây con 2-3 lá và trước khi ra hoa.
4.1.1. Điều tra thành phần nhện hại và nhện bắt mồi trên đậu cove và đậu đũa tại Văn Đức- Gia Lâm đũa tại Văn Đức- Gia Lâm
Bảng 4.1. Thành phần nhện bắt mồi và nhện hại trên đậu cove tại Văn Đức- Gia Lâm vụ Xuân hè 2019
STT Tên tiếng
việt Tên latinh Họ
Mức độ phổ biến (%) Tháng 4 Tháng 5 I Nhện hại 1 Nhện đỏ son Tetranychus
cinnabarinus Boisduval Tetranychidae + +
2 Nhện đỏ 2 chấm Tetranychus urticae Koch Tetranychidae +++ ++++ II Nhện bắt mồi 3 Nhện bắt mồi Amblyseius largoensis (Muma) Phytoseiidae + ++ 4 Nhện bắt mồi Neoseiulus
longispinosus (Evans) Phytoseiidae ++ ++
5 Nhện bắt mồi
Amblyseius
tamatavensis Blommers Phytoseiidae + +
Ghi chú: >75%: rất phổ biến (++++); 50 – 75%: phổ biến (+++); 25 – 50%: ít phổ biến (++); < 25: rất ít (+); không xuất hiện (-)
Qua bảng 4.1, về thành phần : có 2 loài nhện hại xuất hiện trên đồng ruộng đó là nhện đỏ 2 chấm và đỏ son, nhện đỏ 2 chấm xuất hiện phổ biến (tháng 4) và rất phổ biến (tháng 5), trong khi nhện đỏ son xuất hiện rất ít điều này cho thấy nhện đỏ 2 chấm là nhện hại chính trên ruộng đậu cove. Có 3 loài NBM được tìm thấy đều xuất hiện rất ít đến ít phổ biến, trong đó NBM Neoseiulus longispinosus
(Evans) xuất hiện nhiều hơn so với 2 loài nhện còn lại, NBM N. longispinosus
được coi là nhện bản địa tại Việt Nam.
Kết quả này cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu của Lu & cs. (2017) cho rằng nhện đỏ hai chấm Tetranychus urticae Koch là loại rất nguy hiểm và gây hại phổ biến cho cây rau như đậu cove, cà chua, dưa chuột, dâu tây,…
Theo nghiên cứu của Lương Thị Huyền (2016) NBM N. longispinosus xuất hiện rất phổ biến trên cây bưởi Diễn tại Chương Mỹ, Hà Nội năm 2015 điều này cho thấy NBM N. longispinosus có thể phát triển tốt trên nhiều loại cây trồng khác nhau.
Bảng 4.2. Diễn biến mật độ nhện hại và nhện bắt mồi trên đậu cove tại Văn Đức- Gia Lâm vụ Xuân hè năm 2019
Ngày
điều tra Giai đoạn sinh trưởng
Mật độ (con/lá) Tetranychus urticae Neoseiulus longispinosus Amblyseius largoensis 17/03 Cây con 2-3 lá 6,89 1,56 1,13 24/03 Cây con 5-6 lá 8,10 2,34 1,19 31/03 Leo giàn 10,06 2,52 1,34 07/04 Leo giàn 9,26 2,22 1,48 14/04 Ra hoa 9,76 2,27 1,69 21/04 Ra hoa 10,97 2,77 2,09 28/04 Thu quả 11,36 3,07 2,53 05/05 Thu quả 11,66 3,12 2,38 12/05 Thu quả 11,09 3,23 2,39 19/05 Thu quả 12,69 3,50 2,65 26/05 Cây già và chết dần 10,42 2,60 1,91
Theo bảng 4.2, nhện hại và NBM có mật độ thấp nhất trong giai đoạn cây con 2-3 lá. T. urticae (6,89 con/lá), N. longispinosus (1,56 con/lá), A. largoensis
(1,13 con/lá) và cao nhất khi cây thu quả lần cuối Tetranychus urticae (12,69 con/lá), N. longispinosus (3,50 con/lá), A. largoensis (2,65 con/lá). Mật độ nhện