Mồi ITS Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide 5’->3’
Xuôi ITS-F ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG
Ngược ITS-R TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC
Phản ứng PCR được tiến hành với thành phần phản ứng trong bảng 2.5
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích ul STT Thành phần Thể tích ul 1 Nước cất ion khử trùng 9,5 2 Master Mix (2X) 12,5 3 Mồi xuôi (10pM/µl) 1 4 Mồi ngược (10pM/µl) 1 5 DNA mẫu (200 ng/µl) 1 Tổng 25
Hỗn hợp được thực hiện với các chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR được thể hiện ở bảng 2.6
Bảng 2.6. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 4 phút 1
2 Biến tính 94 30 giây
Lặp lại 30 chu kỳ
3 Gắn mồi 56 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 45 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 15 8
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra gel agarose 1 % với sự có mặt thang DNA chuẩn 1kb, nhuộm bản gel trong ethydium bromide 5-10 phút, rửa lại bằng nước và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.
2.3.3. Phương pháp phân tích trình tự nucleotide
Sử dụng các phần mềm DNAstar, BioEdit, BLAST, để phân tích trình tự gen.
g
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu cây Bảy lá một hoa
Mẫu cây được cho là Bảy lá một hoa thu thập tại huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu hình thái và giải phẫu.
3.1.1. Đặc điểm hình thái của mẫu cây Bảy lá một hoa
Sử dụng phương pháp mô tả hình thái theo Phạm Hoàng Hộ (1999), các thông tin thu thập được về cây Bảy lá một hoa thu thập ở huyện Sìn Hồ ,tỉnh Lai Châu được trình bày ở hình 3.1.
Hình 3.1. Hình thái cơ quan sinh dưỡng của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập ở
huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu
a, b: Hình thái cây Bảy lá một hoa
c: Hình ảnh cuống lá mẫu cây Bảy lá một hoa d: Hình ảnh lá mẫu cây Bảy lá một hoa
e, f: Hình ảnh thân mẫu cây Bảy lá một hoa g: Hình ảnh rễ mẫu cây Bảy lá một hoa
a b c d
f
Theo hình 3.1, mẫu thu thập được có một thân thẳng nổi lên trên mặt đất, dài 40-50 cm. Từ phần nổi trên mặt đất đến 50 cm (khoảng 2/3 thân) có một tầng 5 lá mọc vòng (hình a). Hoa mọc ở đỉnh cành, cuống hoa dài 14 cm. Nhụy màu tím đỏ, bầu thường gồm 3 ngăn (hình b). Các lá có cuống dài 2-3 cm có màu tím (hình c). Phiến lá hình trứng, chiều rộng lá 10-12 cm (hình d), chiều dài lá 17cm. Mặt lá bên trên màu xanh đậm, có gân lá, mặt lá dưới màu xanh nhạt hơn. Từ cuống lá xuất phát ra 5 gân hình cung. Phần thân từ mặt đất đến tầng lá vòng có màu tím nhạt, trơn, nhẵn. Phần thân từ tầng lá mọc vòng đến tầng lá tiếp theo có màu xanh nhạt dài chừng 25-27 cm. Phần thân củ nằm dưới mặt đất có nhiều rễ phụ, kích thước tương đối đồng đều, rễ dài từ 8-12 cm (hình e). Phía gốc cây có một số lá thoái hóa thành vảy bao lấy phần thân cây phía trên. Đối chiếu với mô tả của Phạm Hoàng Hộ (1999) về mặt hình thái mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu thuộc loài Paris fargesii [5].
3.1.2. Đặc điểm giải phẫu của mẫu cây Bảy lá một hoa
Sử dụng phương pháp nhuộm kép tiêu bản tế bào, chúng tôi tiến hành làm tiêu bản với các phần thân, rễ, cuống lá. Kết quả nghiên cứu trình bày trên hình 3.2, 3.3, 3.4. Mạch gỗ Biểu bì Libe Mô mềm
Theo hình 3.2, lát cắt giải phẫu cuống lá cây Bảy lá một hoa có các mô sau: biểu bì, mô mềm, bó mạch gỗ, bó libe. Biểu bì là lớp tế bào mỏng ở ngoài cùng. Các tế bào biểu bì xếp sít nhau. Sau lớp biểu bì là mô mềm. Các tế bào mô mềm có hình hơi tròn hoặc đa giác tròn ở góc, các tế bào mô mềm chiếm diện tích trong tế bào. Trong cùng là mạch dẫn bao gồm mạch gỗ và libe. Khi nhuộm màu hệ mạch gỗ bắt màu xám, hệ mạch libe bắt màu hồng.
Kết quả nghiên cứu phù hợp với công bố của Hoàng Thị Sản (2003) về giải phẫu cuống lá cây một lá mầm [7].
Mô mềm
Libe
Biểu bì Mạch gỗ
Hình 3.3. Cấu tạo giải phẫu thân
Hình 3.3 mô tả lát cắt ngang của thân cây Bảy lá một hoa. Hình ảnh tiêu bản cho phép quan sát thấy có các phần: biểu bì, mô mềm và các bó dẫn (mạch gỗ và libe). Biểu bì là lớp tế bào mỏng ở ngoài cùng có chức năng bảo vệ các mô bên trong. Mô mềm là những tế bào hình đa giác tròn đầu, các tế bào mô mềm ở lớp ngoài có kích thước lớn hơn những tế bào nằm phía trong. Các bó dẫn nằm rải rác trong lớp mô mềm. Các bó dẫn vòng ngoài nhỏ hơn các bó dẫn vòng trong.
Trong mỗi bó dẫn gồm hệ mạch gỗ là các tế bào lớn, bắt màu xám xếp thành hình lưỡi liềm và hệ mạch libe, gồm những tế bào nhỏ hơn, bắt màu hồng bao quanh mạch gỗ. Thân cây Bảy lá một hoa không có cấu tạo thứ cấp.
Biểu bì Mô mềm ruột
Trung trụ Vỏ trụ
Libe
Nội bì Mạch gỗ
Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu rễ
Hình 3.4 mô tả lát cắt ngang của rễ cây Bảy lá một hoa. Theo đó, rễ cây Bảy lá một hoa có cấu tạo sơ cấp gồm 4 phần chính: biểu bì, ngoại bì, nội bì và trung trụ.
Biểu bì là lớp tế bào bao bọc ngoài cùng xếp sít nhau. Các tế bào biểu bì được gắn chặt với nhau nên dễ bị bóc tách.
Dưới lớp biểu bì có nhiều lớp tế bào dày gọi là ngoại bì. Các tế bào ngoại bì có hình chữ U.
Nội bì (mô mềm vỏ) gồm các tế bào hình đa giác tròn đầu xếp sít nhau, ở các góc có khoảng gian bào. Lớp này nằm sau lớp ngoại bì.
Phần trung trụ nằm ở trung tâm của rễ gồm 4 phần là vỏ trụ, mạch gỗ, mạch libe, mô mềm ruột. Lớp vỏ trụ, nằm sát nội bì là các lớp tế bào hình chữ nhật xếp sít nhau thành vòng bao quanh hệ mạch. Tiếp đến là libe gồm các tế bào hình trứng cạnh nhau bắt màu hồng, xếp xen kẽ các bó gỗ với các tế bào xếp liền nhau bắt màu xám sát vỏ trụ. Cuối cùng là mô mềm ruột nằm ở trong cùng của trụ giữa, gồm những tế bào hình bầu dục xếp sít nhau, không có khoảng gian bào.
Kết quả phân tích giải phẫu mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập ở huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu theo Hoàng Thị Sản và cộng sự [1990] là mẫu điển hình của cây một lá mầm ưa bóng.
Để có các thông tin về đặc điểm phân tử của cây Bảy lá một hoa thu được chúng tôi tiếp tục nghiên cứu trình tự đoạn gen matK, vùng gen ITS.
3.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm mã vạch DNA của mẫu cây Bảy lá một hoa
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Lá non của cây Bảy lá một hoa thu thập tại huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu được sử dụng làm vật liệu tách chiết DNA tổng số, mẫu được kí hiệu là SH. Để đánh giá mức độ tinh sạch, nguyên vẹn của phân tử DNA sau khi tách chiết chúng tôi sử dụng phương pháp điện di. Kết quả thí nghiệm được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1 % và thể hiện ở hình 3.5.
Hình 3.5. Kết quả tách chiết DNA tổng số của cây Bảy lá một hoa
Nghiên cứu trên hình 3.5 thu được đoạn băng DNA là một băng sáng, rõ và gọn.
3.2.2. Kết quả khuếch đại và phân tích trình tự nucleotide đoạn gen matK
Sau khi tách chiết và tinh sạch DNA tổng số, tiến hành nhân gen matK
bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi được ký hiệu matK-F và matK-R. Sản phẩm
M SH
1000 bp
800 bp
750 bp
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen matK bằng kỹ thuật PCR
M: maker 1 kb; SH: sản phẩm PCR của gen matK mẫu Sìn Hồ
Kết quả khuếch đại đoạn gen matK cho thấy, trên hình ảnh điện di chỉ
xuất hiện một băng sản phẩm với kích thước khoảng 800 bp phù hợp với tính toán lý thuyết về kích thước đoạn gen matK nhân bản bằng kỹ thuật PCR. Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, mẫu được đem đi giải trình tự trên máy giải trình tự tự động tại Viện Công nghệ Sinh học.
Gen matK được tinh sạch và đọc trực tiếp trên máy xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động và blast trên NCBI, kết quả Blast được trình bày ở hình 3.7
Hình 3.7. Kết quả Blast trình tự gen matK
Theo hình 3.7 đoạn gen matK của cây Bảy lá một hoa thu ở Sìn Hồ được so sánh với 9 trình tự trên GenBank với độ tương đồng đều là 98%. Kết quả nghiên cứu như vậy khẳng định trình tự mẫu nghiên cứu là trình tự đoạn matK thuộc chi
Paris. Kết quả phân tích đoạn trình tự nucleotide bằng phần mềm Bioedit thì thu
Hình 3.8. Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập ở Sìn Hồ, Lai Châu
Sử dụng trình tự đoạn gen matK của 8 loài thuộc chi Paris, với 14 giống khác nhau để so sánh sự tương đồng và khác biệt về đoạn gen matK. Các trình tự gen matK sử dụng được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Một số trình tự đoạn gen matK sử dụng để xác định độ tương đồng và sai khác với mẫu SH
STT Mã số gen Tên loài/ giống Năm công bố
1 GU178944 P. fargesii var. fargesii voucher 2010 2 KM242781 P. forrestii 2015
3 HG475403 P. mairei 2014
4 GU178946 P. marmorata voucher 2011 5 KM242788 P. polyphylla var. yunnanensis 2015 6 KM242785 P. polyphylla var. chinensis 2015 7 GU178949 P. polyphylla var. pseudothibetica voucher 2016 8 GU178947 P. polyphylla var. stenophylla voucher 2011 9 GU178952 P. polyphylla var. yunnanensis voucher 2010 10 GU178945 P. polyphylla var. pseudothibetica voucher 2011 11 JN417377 P. pubescens voucher 2012 12 KM242789 P. rugosa 2015 13 GU178948 P. vietnamensis voucher 2011 14 KM242792 P. vietnamensis 2011 15 SH (mẫu thu thập ở huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu)
Dựa trên trình tự nucleotide của gen matK, bằng phần mềm DNAstar chúng tôi thiết lập bảng độ tương đồng và phân ly ở bảng 3.2.