Theo hình 3.7 đoạn gen matK của cây Bảy lá một hoa thu ở Sìn Hồ được so sánh với 9 trình tự trên GenBank với độ tương đồng đều là 98%. Kết quả nghiên cứu như vậy khẳng định trình tự mẫu nghiên cứu là trình tự đoạn matK thuộc chi
Paris. Kết quả phân tích đoạn trình tự nucleotide bằng phần mềm Bioedit thì thu
Hình 3.8. Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập ở Sìn Hồ, Lai Châu
Sử dụng trình tự đoạn gen matK của 8 loài thuộc chi Paris, với 14 giống khác nhau để so sánh sự tương đồng và khác biệt về đoạn gen matK. Các trình tự gen matK sử dụng được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Một số trình tự đoạn gen matK sử dụng để xác định độ tương đồng và sai khác với mẫu SH
STT Mã số gen Tên loài/ giống Năm công bố
1 GU178944 P. fargesii var. fargesii voucher 2010 2 KM242781 P. forrestii 2015
3 HG475403 P. mairei 2014
4 GU178946 P. marmorata voucher 2011 5 KM242788 P. polyphylla var. yunnanensis 2015 6 KM242785 P. polyphylla var. chinensis 2015 7 GU178949 P. polyphylla var. pseudothibetica voucher 2016 8 GU178947 P. polyphylla var. stenophylla voucher 2011 9 GU178952 P. polyphylla var. yunnanensis voucher 2010 10 GU178945 P. polyphylla var. pseudothibetica voucher 2011 11 JN417377 P. pubescens voucher 2012 12 KM242789 P. rugosa 2015 13 GU178948 P. vietnamensis voucher 2011 14 KM242792 P. vietnamensis 2011 15 SH (mẫu thu thập ở huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu)
Dựa trên trình tự nucleotide của gen matK, bằng phần mềm DNAstar chúng tôi thiết lập bảng độ tương đồng và phân ly ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Độ tương đồng và phân ly dựa trên trình tự gen matK
P. fargesii var. fargesii voucher P. forrestii
P. mairei
P. marmorata voucher P. polyphylla var. yunnanensis P. polyphylla var. chinensis
P. polyphylla var. pseudothibetica voucher P. polyphylla var. stenophylla voucher P. polyphylla var. yunnanensis voucher P. polyphylla var. pseudothibetica voucher P. pubescens voucher
P. rugosa
P. vietnamensis voucher P. vietnamensis SH
Theo kết quả bảng 3.2, trình tự nucleotide của gen matK của mẫu SH (thu
thập tại huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu) có độ tương đồng dao động từ 97,4 % đến 99,9 %. Có 7 trình tự độ tương đồng cùng đạt 99,7 % với mẫu SH, là P. fargesii voucher, P. forrestii, P. mairei, P. polyphylla var. chinensis, P. Polyphylla var. pseudothibetica voucher, P. vietnamensis. voucher, P. vietnamensis. Loài P. marmorata voucher có độ tương đồng đạt 99,8 %. Có 2 loài có độ tương đồng 99,6
% là P. rugosa, P. pubescens. voucher. Trình tự P. polyphylla var. yunnanensis có độ tương đồng 99,0 %, P. polyphylla var. yunnanensis voucher 99,5 %. Trình tự P. polyphylla var.stenophylla độ tương đồng thấp nhất, đạt 97,4 %.
Mối quan hệ di truyền về trình tự nucleotide của gen matK thể hiện trên sơ đồ hình cây 3.10. Kết quả biểu diễn trên hình 3.10 cho thấy sự phân bố của các loài trong chi Paris, cũng như các giống trong các loài có sự phân tán, sự
phân bố tạo thành 2 nhánh chính. Đoạn gen matK của mẫu SH nằm trong
nhánh chính thứ nhất có tới 14 mẫu. Như vậy, dựa vào trình tự đoạn gen matK
thì mẫu SH có quan hệ gần với tất cả các loài đã so sánh. Khoảng cách xa nhất về đoạn gen matK của mẫu SH đó là với một giống của loài Paris polyphylla
nằm độc lập ở nhánh 2
Hình 3.9. Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền giữa các loài Bảy lá một hoa
trong chi Paris dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK.
Paris polyphylla var. chinensis Paris pubescens voucher Paris polyphylla var. yunanensis
Paris polyphylla var. yunnanensis voucher
Paris mairei Paris vietnamensis Paris forrestii Paris rugosa
Paris fargesii var. Fargesii SH
Paris marmorata
Paris polyphylla var. pseudothibetica Paris vietnamensis voucher Paris polyphyla. stenophylla Paris polyphylla
3.2.3. Kết quả khuếch đại và phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS
Sau khi tách chiết và tinh sạch DNA tổng số, tiến hành nhân vùng gen
ITS bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi được ký hiệu ITS-F và ITS-R (bảng 2.4).
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1 % được thể hiện ở hình 3.10. Kết quả khuếch đại vùng gen ITS cho thấy, trên hình ảnh điện di chỉ xuất hiện một băng sản phẩm với kích thước khoảng 800 bp. Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, mẫu được đem đi giải trình tự trên máy giải trình tự tự động tại Viện Công nghệ Sinh học.
M SH
800 bp 800 bp
Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại vùng gen ITS
bằng kỹ thuật PCR
M: maker 1 kb; SH: sản phẩm PCR của vùng gen ITS mẫu Sìn Hồ
Vùng gen ITS được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động và Blast trên NCBI, kết quả Blast được trình bày ở hình 3.11
1000 bp