Có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để xác định đột biến gen, trong nghiên cứu này sử dụng một số kỹ thuật cơ bản như: PCR, giải trình tự gen để xác định các đột biến trên gen SLC25A13.
1.2.1. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)
PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử phổ biến, nhằm mục đích tạo ra lượng lớn bản sao DNA trong ống nghiệm dựa trên các chu kỳ nhiệt. Kỹ thuật này được phát minh vào năm 1985 bởi nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis, từ đó tạo nên bước tiến lớn trong việc nghiên cứu Y-sinh học trên toàn thế giới.17
1.2.1.1. Nguyên tắc chung của PCR
Dựa trên khả năng biến tính hay hồi tính của DNA bởi nhiệt độ và hoạt tính của enzyme DNA polymerase có khả năng tổng hợp mạch mới từ DNA khuôn với nguyên liệu là 4 loại nucleotide tự do. Mỗi phản ứng PCR là một chuỗi liên tiếp nhiều chu kỳ nhiệt, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn chính:
- Giai đoạn biến tính: chuỗi xoắn kép DNA khuôn bị biến tính, tách nhau khỏi thành 2 chuỗi đơn.
kéo dài mồi.
- Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ lại được nâng lên đến nhiệt độ tối ưu của enzyme xúc tác cho quá trình kéo dài.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng làm các DNA nền để tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Số lượng chu kỳ của mỗi phản ứng PCR phụ thuộc số lượng khuôn DNA ban đầu, thường 30 chu kỳ và không quá 40 chu kỳ. Sau mỗi chu kỳ sẽ được tăng gấp đôi lượng DNA của lần trước. Sau n chu kỳ sẽ có 2n bản sao DNA giống DNA ban đầu. Nhờ vậy, có đủ lượng DNA để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp theo như: điện di, nhuộm, tạo dòng hoặc giải trình tự.17,18
1.2.1.2. Các thành phần tham gia của phản ứng PCR
Các thành phần tham gia gồm có: DNA khuôn, mồi, các nucleotide tự do, enzyme DNA polymerase, dung dịch đệm. (Hình 1.12)
- DNA khuôn: Đoạn khuôn DNA (DNA template, DNA target) tinh sạch là một yếu tố quan trọng, giúp phản ứng PCR tạo được các sản phẩm chính xác. Kích thước đoạn DNA khuôn nhỏ hơn 3kb cho kết quả nhân gen tốt nhất.
- Mồi: Là những đoạn oligonucleotide mạch đơn dài 6-100bp (thường có độ dài 20-30bp), có trình tự bazơ nitơ bổ sung với trình tự bazơ nitơ của 2 đầu đoạn DNA khuôn. Mỗi cặp mồi có 1 mồi xuôi và 1 mồi ngược.
- Các nucleotide (dNTP): Là hỗn hợp của 4 loại dATP, dTTP,dGTP, dCTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA.
- Enzyme DNA polymerase: Là yếu tố đóng vai trò quyết định hiệu quả của phản ứng PCR. Enzyme thường được sử dụng hiện nay là Taq polymerase,
được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở nhiệt độ cao. Hàm lượng enzyme ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả PCR.
- Dung dịch đệm: Thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy theo loại enzyme được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+. Nó hình thành một phức hợp hòa tan với dNTP, làm tăng nhiệt độ nóng chảy của DNA mạch đôi và tăng khả năng bắt cặp và gắn của đoạn mồi vào khuôn.
Hình 1.12. Thành phần và nguyên lý của phản ứng PCR Nguồn: Inlichtet
1.2.1.3. Phân tích sản phẩm PCR:
Phân tích sản phẩm PCR thu được giúp cho việc tối ưu hóa các thành phần tham gia và điều kiện của phản ứng để thu được sản phẩm DNA đúng yêu cầu. Thường sau khi thực hiện phản ứng PCR người ta tiến hành điện di sản phẩm trên gel agarose để kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR thu được.17
học người Anh Fred Sanger và cộng sự vào năm 1977. Phương pháp này thực hiện dựa trên kỹ thuật phổ biến là “chain termination-kết thúc chuỗi” bằng việc sử dụng các dideoxynucleotide (ddNTP). Các ddNTP cũng tương tự như các nucleotide hoặc deoxy thông thường. Tuy nhiên, chúng đã được chỉnh sửa làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường. Nhóm 3’-OH có vai trò cho phép gắn thêm một nucleotide mới vào chuỗi. Khi nucleotide dideoxy được thêm vào chuỗi, không có nhóm 3’-OH nên nucleotide không được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại. Do đó khi thực hiện phản ứng PCR với tám thành phần nucleotide như trên sẽ tạo ra các chuỗi ADN có độ dài hơn kém nhau 1 base. Dựa vào sự sai khác về độ dài các đoạn DNA hiển thị trên bản gel sau điện di để xác định trình tự trong gen.19
Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp giải trình tự bằng máy tự động. Kỹ thuật giải trình tự DNA tự động (Dye termination sequencing) sử dụng các ddNTP có đánh dấu huỳnh quang đã giúp cho việc sắp xếp trình tự DNA trở nên nhanh chóng và hiệu quả hơn. Mỗi loại ddNTP được gắn một màu có bước sóng phát xạ huỳnh quang khác nhau cho phép thực hiện giải trình tự trong một phản ứng duy nhất. Hệ thống điện di mao quản được sử dụng để đọc trình tự DNA một cách tự động. Hệ thống detector gồm các camera có chùm tia laser đi qua nó để ghi nhận tín hiệu huỳnh quang một cách chính xác. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng và được camera ghi nhận và lưu lại thành một cường độ đỉnh sáng (peak) trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với nhau và phân tích thành trình tự của đoạn DNA.
Hình 1.13. Sơ đồ khối một máy giải trình tự gen tự động Nguồn: Sawakinome
DNA:
- Một enzyme DNA polymerase: xúc tác phản ứng kéo dài mạch;
- Một primer: là một đoạn DNA sợi đơn ngắn kết hợp với DNA, là trình tự khởi đầu cho polymerase;
- Trình tự DNA
- 4 loại deoxy nucleotide DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
- 4 loại dideoxy nucleotide (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) được đánh dấu huỳnh quang.
Hình 1.14 . Sự khác nhau giữa dNTP và ddNTP Nguồn: Gentis
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại khoa Kỹ thuật Y học – Đại học Y Hà Nội và phòng xét nghiệm Chemedic Việt Nam trong thời gian từ 11/2021 đến 05/2022.
2.2. Đối tượng nghiên cứu
Gồm 4 bệnh nhi đến khám tại khoa gan mật Bệnh viện Nhi Trung Ương, trong đó có 2 bệnh nhân có kết quả sàng lọc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh bằng MSMS ( kí hiệu là M1, M2) và 2 bệnh nhân có kết quả sinh hóa máu, đông máu ( kí hiệu là M3, M4)
2.3. Phương pháp thiết kế nghiên cứu
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang
2.3.2. Cỡ mẫu nghiên cứu
Gồm 4 mẫu, trong đó có 2 mẫu máu gót chân thấm khô (kí hiệu là M1, M2) và 2 mẫu máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA ( kí hiệu là M3, M4)
2.3.3. Trang thiết bị, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
• Trang thiết bị:
Bảng 2.1. Các thiết bị-vật tư tiêu hao chính
STT Tên thiết bị /vật tư tiêu hao Xuất xứ
1 Máy ly tâm Thermofisher, Mỹ
2 Máy lắc vortex Velp – Ý
4 Máy quang phổ Fastgene NanoView Nhật Bản 5 Máy soi gel bằng đèn UV – UK Nhật Bản
Nga 8 Máy giải trình tự ABI 3500 Applied
Biosystem, Mỹ 9 Pipet bán tự động các loại Thermofisher, Anh 10 Đầu côn, ống ly tâm, cột tách mẫu, ống eppendorf Cung cấp theo hệ
máy • Hóa chất:
- Kit tách chiết DNA (QIAamp blood mini kit, Germany) - Kit tinh sạch (QIAquick PCR Purification, Germany)
- Kit giải trình tự Bigdye terminator v3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystem, USA)
- Hóa chất thực hiện phản ứng PCR (Master Mix 2X PCR, Intron, Hàn Quốc)
- Hóa chất điện di: dung dịch đệm TAE 10X (Norgen Biotek, Canada), Bột Agarose (Cleaver Scientific, Anh), chất nhuộm DNA (Redsafe 20 000X Cleaver Scientific, Anh), thang chuẩn DNA (Ladder 100 bp, Cleaver Scientific, Anh)
- Các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen SLC25A13 gây thiếu hụt citrin được
đặt tổng hợp từ công ty Phù Sa (Việt Nam)
- Mẫu DNA chứng (mẫu DNA không chứa đột biến) được cung cấp bởi Trung tâm xét nghiệm Chemedic Việt Nam.
Bảng 2.2. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu để phát hiện 28 đột biến STT STT Trình tự mồi Ta (oC) Đoạn gen khuếch đại Kích thước sản phẩm (bp) Đột biến 1 F GGAGAGTACAAGTTCTGGTC 57,5 130690- 131115 426 8(IV) R ACTAGTTGCCTTCTTCACCC 2 F TCACTCATTCCAGTGCCTTG 57,5 132388- 132943 556 9,10(I),11 R CAATGCCGCAAAGGCAACTG 3 F TTGGGCTGTAGCAATGTGCC 58,5 137473- 137872 557 14, 15, 16 R CTAGATGCCTCCAGCCTACT 4 F CTCCTGAAACATCAGTGATGC 57,5 151800- 152232 433 17(V) R CCTAGTAGACTCTGCCCTTG 5 F CCAGCAGTTCAAAGCACAGTTA 57,5 199972- 200674 498 19-23 R GACTGAGGTACCTTTCCCTACGA 6 F CTAATTATATCTGTGATTTCTCCA 60,0 200368- 200674 307 24-28 R GGAGTTGATACATTCTCATCAG 7 F CTGCCTGGCCGTATCGC 57,5 70 - 315 246 1 R CATTTTGCTCCGCCTGTGG 8 F AGTCTTTGGATTAGGCTGGCTTT 58,5 44650- 44911 262 2 R TCTTTGAACTGTTGGGAGATAATGGTC 9 F TGTTTGCAACAGAAAAAAAACACTACA 58,5 128704- 129213 510 3,4,5,6, 7(X) R CTAGAGAGCACGGAAGTAATTGG 10 F ATAACTGGCATTGGGAAAGACTAGA 57,5 136832- 137504 509 12,13 R CTCAGTGATGTTTTTAACTGTGCATT 11 F CCTCTGCAGCTTGGGTAGAACATC 60,0 175227- 175727 501 18 R CCCTCCTTCAGCCTCCACATTAA
1) Thu thập mẫu nghiên cứu
- Thu thập các mẫu máu
- Thu thập bệnh án nghiên cứu theo danh sách. - Thu thập các thông tin khác.
2) Tách chiết DNA
- Nguyên tắc kỹ thuật tách DNA: sự tách chiết DNA dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước).
- Thực hiện theo đúng quy trình tách chiết DNA từ mẫu máu khô và mẫu máu toàn phần
Thu thập mẫu nghiên cứu
Tách chiết DNA
PCR-nhân bản đoạn gen cần xác định đột biến
Điện di-kiểm tra sản phẩm PCR
Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger
- Đo nồng độ DNA tổng số sau tách chiết DNA, đảm bảo có DNA với nồng độ khoảng ≥ 10 ng/µl, độ tinh sạch khoảng 1,8 - 2,0. Nếu nồng độ và độ tinh sạch không đảm bảo cần tách chiết lại đến khi đảm bảo để chạy được PCR.
- Nếu chưa sử dụng cần lưu trữ và bảo quản DNA trong tủ âm (< 0oC).
Quy trình tách chiết DNA từ mẫu máu khô:
Bước 1: Dùng máy bấm lỗ giấy chuyên dụng lấy 3 mảnh giấy máu khô
đường kính 3mm vào ống Eppendorf dung tích 1.5 ml.
Bước 2: Thêm 180µl Buffer ATL vào ủ ở 85oC trong 10 phút, ly tâm nhanh 10 giây để kéo hết dung dịch còn dính trên nắp xuống.
Bước 3: Thêm 20µl dung dịch Proteinase K và vortex trong 15 giây, ủ ở 560C trong 1 giờ, ly tâm nhanh 10 giây.
Bước 4: Thêm 200µl Buffer AL, vortex 15 giây, ủ ở 70oC trong 10 phút, Ly tâm nhanh 10 giây.
Bước 5: Thêm 200µl ethanol (96–100%) vào ống, vortex 15 giây, ly tâm nhanh 10 giây.
Bước 6: Chuyển toàn bộ dung dịch vào ống cột lọc, ly tâm 8000 vòng/phút
trong 1 phút, bỏ dung dịch trong ống thu.
Bước 7:Thêm 500µl Buffer AW1 vào ống cột lọc, ly tâm 8000 vòng /phút trong 1 phút, đổ bỏ phần dịch đáy ống.
Bước 8: Thêm 500µl Buffer AW2 vào ống cột lọc, ly tâm 14000 vòng /phút trong 3 phút, đổ bỏ phần dịch đáy ống.
Bước 9: Đặt cột lọc sang ống Eppendorf 1.5ml mới, ly tâm 14000
vòng/phút trong 1 phút, bỏ ống thu.
Bước 10: Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf 1.5ml mới, thêm 150µl Buffer AE, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 12: Bảo quản DNA trong tủ mát hoặc để -20oC , tùy theo mục đích xét nghiệm
Quy trình tách chiết DNA từ mẫu máu toàn phần
Bước 1: Hút 200 µl máu toàn phần chống đông EDTA vào ống Eppendorf
dung tích 1.5 ml.
Bước 2: Thêm 20 µl Proteinase K và 5 µl RNase A vào và trộn đều Bước 3: Thêm 200 µl Buffer BL vào, đóng nắp và vortex trong 10 giây
Bước 4: Để ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút
Bước 5: Ủ ở nhiệt độ 56oC trong 10 phút
Bước 6: Spindown trong 10 giây
Bước 7: Thêm 200 µl ethanol (96–100%) vào ống và trộn đều.
Bước 8: Chuyển toàn bộ dung dịch trong ống trên vào ống cột lọc, ly tâm
13500 vòng trong 5 phút, đổ bỏ phần dịch đáy ống.
Bước 9: Thêm 700 µl Buffer WA vào ống cột lọc trên, ly tâm 13500 vòng trong 5 phút, đổ bỏ phần dịch đáy ống.
Bước 10: Thêm 700 µl Buffer WB vào ống cột lọc trên, ly tâm 13500 vòng trong 5 phút, đổ bỏ phần dịch đáy ống.
Bước 11: Chuyển ống cột lọc trên sang ống Eppendorf 1.5 ml rồi làm khô
bằng cách ly tâm 13500 vòng trong 3 phút.
Bước 12: Chuyển ống cột lọc trên sang ống Eppendorf 1.5 ml mới.
Bước 13: Thêm 50 µl Buffer CE vào ống cột lọc trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 13500 vòng trong 3 phút.
Bước 14: Lấy ống cột lọc phía trên ra, phần dịch dưới đáy ống Eppendorf
1.5 ml là DNA ta cần thu.
Bước 15: Đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA bằng máy quang phổ ở
bước sóng 260nm/280nm. Nếu chỉ số A260/280nm từ 1.8 – 2.2 là DNA tinh sạch.
Bước 16: Bảo quản DNA trong tủ mát hoặc để -20oC , tùy theo mục đích xét nghiệm.
3) Nhân bản các đoạn gen cần xác định đột biến
- Nguyên tắc kỹ thuật: dựa trên cơ sở tính biến tính, hồi tính của DNA, và hoạt tính của các DNA polymerase có khả năng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại nucleotide. Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn.
- Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại các đoạn gen chứa đột biến cần xác định.
- Thực hiện theo đúng quy trình kỹ thuật PCR
Quy trình kỹ thuật PCR:
- Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, hóa chất, mồi và mẫu DNA. - Thành phần của mỗi ống chạy PCR bao gồm:
Thành phần Thể tích
Master Mix 2X 10 µl
Mồi xuôi và mồi ngược loại tương ứng (5 µM) 5 µl
DNA mẫu 5 µl
Tổng thể tích 20 µl
+ Gắn mồi: Ta trong 30 giây + Kéo dài: 72oC trong 30 giây
+ Kéo dài hoàn toàn: 72oC trong 5 phút + Bảo quản: 10oC
4) Điện di sản phẩm PCR
• Điện di trên gel agarose:
- Mục đích: kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cho việc giải trình tự
- Yêu cầu: chạy điện di trên gel agarose, đảm bảo băng điện di rõ nét, không có sản phẩm phụ, kích thước bằng với mẫu chuẩn.
- Nguyên tắc kỹ thuật: điện di là hiện tượng các phân tử mang điện dịch chuyển trong điện trường dưới tác dụng của dòng điện, phân tử tích điện âm di chuyển về cực (+) và phân tử tích điện dương dịch chuyển về cực (-). Acid nucleic là phân tử mang điện tích âm nhờ khung phosphat của mình, dưới tác dụng của dòng điện một chiều acid nucleic sẽ di chuyển về cực dương. Các đoạn DNA có kích thước khác nhau sẽ di chuyển khác nhau. Tùy mục đích, có thể sử dụng các chất giá khác nhau để điện di DNA, phổ biến nhất là sử dụng gel agarose.
- Quy trình kỹ thuật: thực hiện theo đúng quy trình kỹ thuật
Quy trình kiểm tra sản phẩm PCR:
Điện di DNA trên gel agarose để kiểm tra sản phẩm PCR thu được. x 40 chu kỳ
• Chuẩn bị gel điện di (đủ cho 1 mẫu/1 giếng): - Nước : 4,5 ml - TAE 10X: 0,5 ml - Agar: 0,1 g Tổng thể tích: 5 ml - Thêm Redsafe: 0,25 µl - Đổ gel
• Tra mẫu và maker vào giếng:
- Tra 3 µl marker loại 100 bp vào 1 giếng.
- Với các giếng còn lại, mỗi giếng tra 3 µl sản phẩm DNA tương ứng • Chạy điện di:
- Cài đặt máy và tiến hành điện di với hiệu điện thế 130 V, 300 mA trong 30 phút.
• Quan sát kết quả:
Quan sát bản gel dưới ánh sáng tử ngoại (UV)
- Nếu chưa sử dụng cần lưu trữ, bảo quản sản phẩm PCR trong tủ âm (< 0oC)
5) Giải trình tự với các cặp mồi tương ứng
- Nguyên tắc kỹ thuật: giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA, dựa trên nguyên tắc sử dụng các nucleotide tự do ddNTP do F.Sanger và cộng sự phát minh .