Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.3. Trang thiết bị, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
• Trang thiết bị:
Bảng 2.1. Các thiết bị-vật tư tiêu hao chính
STT Tên thiết bị /vật tư tiêu hao Xuất xứ
1 Máy ly tâm Thermofisher, Mỹ
2 Máy lắc vortex Velp – Ý
4 Máy quang phổ Fastgene NanoView Nhật Bản 5 Máy soi gel bằng đèn UV – UK Nhật Bản
Nga 8 Máy giải trình tự ABI 3500 Applied
Biosystem, Mỹ 9 Pipet bán tự động các loại Thermofisher, Anh 10 Đầu côn, ống ly tâm, cột tách mẫu, ống eppendorf Cung cấp theo hệ
máy • Hóa chất:
- Kit tách chiết DNA (QIAamp blood mini kit, Germany) - Kit tinh sạch (QIAquick PCR Purification, Germany)
- Kit giải trình tự Bigdye terminator v3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystem, USA)
- Hóa chất thực hiện phản ứng PCR (Master Mix 2X PCR, Intron, Hàn Quốc)
- Hóa chất điện di: dung dịch đệm TAE 10X (Norgen Biotek, Canada), Bột Agarose (Cleaver Scientific, Anh), chất nhuộm DNA (Redsafe 20 000X Cleaver Scientific, Anh), thang chuẩn DNA (Ladder 100 bp, Cleaver Scientific, Anh)
- Các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen SLC25A13 gây thiếu hụt citrin được
đặt tổng hợp từ công ty Phù Sa (Việt Nam)
- Mẫu DNA chứng (mẫu DNA không chứa đột biến) được cung cấp bởi Trung tâm xét nghiệm Chemedic Việt Nam.
Bảng 2.2. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu để phát hiện 28 đột biến STT STT Trình tự mồi Ta (oC) Đoạn gen khuếch đại Kích thước sản phẩm (bp) Đột biến 1 F GGAGAGTACAAGTTCTGGTC 57,5 130690- 131115 426 8(IV) R ACTAGTTGCCTTCTTCACCC 2 F TCACTCATTCCAGTGCCTTG 57,5 132388- 132943 556 9,10(I),11 R CAATGCCGCAAAGGCAACTG 3 F TTGGGCTGTAGCAATGTGCC 58,5 137473- 137872 557 14, 15, 16 R CTAGATGCCTCCAGCCTACT 4 F CTCCTGAAACATCAGTGATGC 57,5 151800- 152232 433 17(V) R CCTAGTAGACTCTGCCCTTG 5 F CCAGCAGTTCAAAGCACAGTTA 57,5 199972- 200674 498 19-23 R GACTGAGGTACCTTTCCCTACGA 6 F CTAATTATATCTGTGATTTCTCCA 60,0 200368- 200674 307 24-28 R GGAGTTGATACATTCTCATCAG 7 F CTGCCTGGCCGTATCGC 57,5 70 - 315 246 1 R CATTTTGCTCCGCCTGTGG 8 F AGTCTTTGGATTAGGCTGGCTTT 58,5 44650- 44911 262 2 R TCTTTGAACTGTTGGGAGATAATGGTC 9 F TGTTTGCAACAGAAAAAAAACACTACA 58,5 128704- 129213 510 3,4,5,6, 7(X) R CTAGAGAGCACGGAAGTAATTGG 10 F ATAACTGGCATTGGGAAAGACTAGA 57,5 136832- 137504 509 12,13 R CTCAGTGATGTTTTTAACTGTGCATT 11 F CCTCTGCAGCTTGGGTAGAACATC 60,0 175227- 175727 501 18 R CCCTCCTTCAGCCTCCACATTAA
1) Thu thập mẫu nghiên cứu
- Thu thập các mẫu máu
- Thu thập bệnh án nghiên cứu theo danh sách. - Thu thập các thông tin khác.
2) Tách chiết DNA
- Nguyên tắc kỹ thuật tách DNA: sự tách chiết DNA dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước).
- Thực hiện theo đúng quy trình tách chiết DNA từ mẫu máu khô và mẫu máu toàn phần
Thu thập mẫu nghiên cứu
Tách chiết DNA
PCR-nhân bản đoạn gen cần xác định đột biến
Điện di-kiểm tra sản phẩm PCR
Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger
- Đo nồng độ DNA tổng số sau tách chiết DNA, đảm bảo có DNA với nồng độ khoảng ≥ 10 ng/µl, độ tinh sạch khoảng 1,8 - 2,0. Nếu nồng độ và độ tinh sạch không đảm bảo cần tách chiết lại đến khi đảm bảo để chạy được PCR.
- Nếu chưa sử dụng cần lưu trữ và bảo quản DNA trong tủ âm (< 0oC).
Quy trình tách chiết DNA từ mẫu máu khô:
Bước 1: Dùng máy bấm lỗ giấy chuyên dụng lấy 3 mảnh giấy máu khô
đường kính 3mm vào ống Eppendorf dung tích 1.5 ml.
Bước 2: Thêm 180µl Buffer ATL vào ủ ở 85oC trong 10 phút, ly tâm nhanh 10 giây để kéo hết dung dịch còn dính trên nắp xuống.
Bước 3: Thêm 20µl dung dịch Proteinase K và vortex trong 15 giây, ủ ở 560C trong 1 giờ, ly tâm nhanh 10 giây.
Bước 4: Thêm 200µl Buffer AL, vortex 15 giây, ủ ở 70oC trong 10 phút, Ly tâm nhanh 10 giây.
Bước 5: Thêm 200µl ethanol (96–100%) vào ống, vortex 15 giây, ly tâm nhanh 10 giây.
Bước 6: Chuyển toàn bộ dung dịch vào ống cột lọc, ly tâm 8000 vòng/phút
trong 1 phút, bỏ dung dịch trong ống thu.
Bước 7:Thêm 500µl Buffer AW1 vào ống cột lọc, ly tâm 8000 vòng /phút trong 1 phút, đổ bỏ phần dịch đáy ống.
Bước 8: Thêm 500µl Buffer AW2 vào ống cột lọc, ly tâm 14000 vòng /phút trong 3 phút, đổ bỏ phần dịch đáy ống.
Bước 9: Đặt cột lọc sang ống Eppendorf 1.5ml mới, ly tâm 14000
vòng/phút trong 1 phút, bỏ ống thu.
Bước 10: Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf 1.5ml mới, thêm 150µl Buffer AE, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 12: Bảo quản DNA trong tủ mát hoặc để -20oC , tùy theo mục đích xét nghiệm
Quy trình tách chiết DNA từ mẫu máu toàn phần
Bước 1: Hút 200 µl máu toàn phần chống đông EDTA vào ống Eppendorf
dung tích 1.5 ml.
Bước 2: Thêm 20 µl Proteinase K và 5 µl RNase A vào và trộn đều Bước 3: Thêm 200 µl Buffer BL vào, đóng nắp và vortex trong 10 giây
Bước 4: Để ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút
Bước 5: Ủ ở nhiệt độ 56oC trong 10 phút
Bước 6: Spindown trong 10 giây
Bước 7: Thêm 200 µl ethanol (96–100%) vào ống và trộn đều.
Bước 8: Chuyển toàn bộ dung dịch trong ống trên vào ống cột lọc, ly tâm
13500 vòng trong 5 phút, đổ bỏ phần dịch đáy ống.
Bước 9: Thêm 700 µl Buffer WA vào ống cột lọc trên, ly tâm 13500 vòng trong 5 phút, đổ bỏ phần dịch đáy ống.
Bước 10: Thêm 700 µl Buffer WB vào ống cột lọc trên, ly tâm 13500 vòng trong 5 phút, đổ bỏ phần dịch đáy ống.
Bước 11: Chuyển ống cột lọc trên sang ống Eppendorf 1.5 ml rồi làm khô
bằng cách ly tâm 13500 vòng trong 3 phút.
Bước 12: Chuyển ống cột lọc trên sang ống Eppendorf 1.5 ml mới.
Bước 13: Thêm 50 µl Buffer CE vào ống cột lọc trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 13500 vòng trong 3 phút.
Bước 14: Lấy ống cột lọc phía trên ra, phần dịch dưới đáy ống Eppendorf
1.5 ml là DNA ta cần thu.
Bước 15: Đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA bằng máy quang phổ ở
bước sóng 260nm/280nm. Nếu chỉ số A260/280nm từ 1.8 – 2.2 là DNA tinh sạch.
Bước 16: Bảo quản DNA trong tủ mát hoặc để -20oC , tùy theo mục đích xét nghiệm.
3) Nhân bản các đoạn gen cần xác định đột biến
- Nguyên tắc kỹ thuật: dựa trên cơ sở tính biến tính, hồi tính của DNA, và hoạt tính của các DNA polymerase có khả năng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại nucleotide. Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn.
- Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại các đoạn gen chứa đột biến cần xác định.
- Thực hiện theo đúng quy trình kỹ thuật PCR
Quy trình kỹ thuật PCR:
- Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, hóa chất, mồi và mẫu DNA. - Thành phần của mỗi ống chạy PCR bao gồm:
Thành phần Thể tích
Master Mix 2X 10 µl
Mồi xuôi và mồi ngược loại tương ứng (5 µM) 5 µl
DNA mẫu 5 µl
Tổng thể tích 20 µl
+ Gắn mồi: Ta trong 30 giây + Kéo dài: 72oC trong 30 giây
+ Kéo dài hoàn toàn: 72oC trong 5 phút + Bảo quản: 10oC
4) Điện di sản phẩm PCR
• Điện di trên gel agarose:
- Mục đích: kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cho việc giải trình tự
- Yêu cầu: chạy điện di trên gel agarose, đảm bảo băng điện di rõ nét, không có sản phẩm phụ, kích thước bằng với mẫu chuẩn.
- Nguyên tắc kỹ thuật: điện di là hiện tượng các phân tử mang điện dịch chuyển trong điện trường dưới tác dụng của dòng điện, phân tử tích điện âm di chuyển về cực (+) và phân tử tích điện dương dịch chuyển về cực (-). Acid nucleic là phân tử mang điện tích âm nhờ khung phosphat của mình, dưới tác dụng của dòng điện một chiều acid nucleic sẽ di chuyển về cực dương. Các đoạn DNA có kích thước khác nhau sẽ di chuyển khác nhau. Tùy mục đích, có thể sử dụng các chất giá khác nhau để điện di DNA, phổ biến nhất là sử dụng gel agarose.
- Quy trình kỹ thuật: thực hiện theo đúng quy trình kỹ thuật
Quy trình kiểm tra sản phẩm PCR:
Điện di DNA trên gel agarose để kiểm tra sản phẩm PCR thu được. x 40 chu kỳ
• Chuẩn bị gel điện di (đủ cho 1 mẫu/1 giếng): - Nước : 4,5 ml - TAE 10X: 0,5 ml - Agar: 0,1 g Tổng thể tích: 5 ml - Thêm Redsafe: 0,25 µl - Đổ gel
• Tra mẫu và maker vào giếng:
- Tra 3 µl marker loại 100 bp vào 1 giếng.
- Với các giếng còn lại, mỗi giếng tra 3 µl sản phẩm DNA tương ứng • Chạy điện di:
- Cài đặt máy và tiến hành điện di với hiệu điện thế 130 V, 300 mA trong 30 phút.
• Quan sát kết quả:
Quan sát bản gel dưới ánh sáng tử ngoại (UV)
- Nếu chưa sử dụng cần lưu trữ, bảo quản sản phẩm PCR trong tủ âm (< 0oC)
5) Giải trình tự với các cặp mồi tương ứng
- Nguyên tắc kỹ thuật: giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA, dựa trên nguyên tắc sử dụng các nucleotide tự do ddNTP do F.Sanger và cộng sự phát minh . Dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, qua hệ thống điện di mao quản. Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh
Cho vào lò vi sóng quay ở nhiệt độ trung bình cao trong 2 phút
Cho vào lò vi sóng quay ở nhiệt độ trung bình cao trong 2 phút
- Kết quả giải trình tự đảm bảo rõ nét, các đỉnh nucleotid rõ, không đứt đoạn, không nhiễu.
Quy trình giải trình tự gen:
• Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose
Bước 1: Dùng dao mổ sạch cắt lấy vùng gel chứa vạch sản phẩm. Bước 2: Cho vùng gel chứa sản phẩm PCR vào tube eppendorf 1.5ml. Bước 3: Thêm 500 µl BNL Buffer / Plus vào mẫu.
Bước 4: Ủ ở nhiệt độ 56℃ trong 15 phút và lắc đều ống sau mỗi 2 – 3 phút
cho đến khi gel tan hoàn toàn.
Bước 5: Làm nguội hỗn hợp mẫu đến nhiệt độ phòng. Và đặt một Cột vào
ống thu gom.
Bước 6: Chuyển hết hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm ở 13500 vòng/5 phút sau
đó loại bỏ dịch ở đáy ống thu gom.
Bước 7: Thêm 750 µl dung dịch Washing vào cột, ly tâm ở 13500 vòng/5
phút sau đó loại bỏ dịch ở đáy ống thu gom.
Bước 8: Chuyển cột vào ống thu gom mới, ly tâm lại ở tốc độ 13500 vòng/5
phút để làm khô màng cột.
Bước 9: Chuyển cột vào tube eppendorf 1.5ml mới.
Bước 10: Thêm 40 µl dung dịch đệm rửa giải (Elution buffer) vào tâm
màng của cột. Để ở nhiệt độ phòng trong 3-5 phút.
Bước 11: Ly tâm ở tốc độ 13500 vòng/5 phút để rửa giải và thu DNA.
• Pha mẫu giải trình tự
- H2O: 6,5 µl
- Buffer Big dye 5X: 1,5 µl - Big dye Terminator v3.1: 1 µl - Mồi F hoặc R (10pmol/µL): 0,5 µl - DNA (đã tinh sạch): 0,5 µl
Tổng thể tích: 10 µl • Chu trình nhiệt
Tương tự chu trình nhiệt của phản ứng PCR (x 25 chu kỳ)
6) Phân tích kết quả
• Kết quả giải trình tự gen:
Kết quả trình tự thu được phân tích trên phần mềm Unipro UGENE khi so sánh với trình tự gen SLC25A13 trên thư viện gen NCBI (Homo sapiens Updated Annotation Release 109.20191205, GRCh38.p13)
- Trình tự nucleotide trên các exon được đọc bằng các tín hiệu huỳnh quang dựa trên nguyên tắc cảm quang, biểu hiện bằng trình tự các đỉnh sóng với mỗi loại nucleotide A, T, G, C lần lượt tương ứng với một màu khác nhau xanh lá, đỏ, đen, xanh dương. Bình thường mỗi vị trí nucleotide chỉ tương ứng 1 đỉnh sóng 1 màu, khi có sự biến đổi về nucleotide, sẽ xuất hiện 2 sóng trên cùng một vị trí hoặc mất hẳn sóng chính và thay bằng đỉnh sóng của một loại nucleotide khác. Kết quả của giải trình tự gen được thể hiện bằng hình ảnh là các đỉnh sóng liên tiếp nhau tương ứng với trình tự của các nucleotide trên exon.
- Nếu mẫu nào không đạt (nhiễu, không đọc được kết quả), cần tinh sạch lại sản phẩm PCR và giải trình tự lại đến khi đọc được kết quả. Nếu vẫn không được cần làm lại PCR, không được thì cần tách lại DNA . Có thể chạy giải trình tự bằng mồi ngược nếu mồi xuôi kết quả vẫn không đọc được.
- Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định đột biến gen SLC25A13 gây thiếu hụt citrin bằng phương pháp giải trình tự Sanger, giúp chẩn đoán để điều trị sớm cho bệnh nhân.
- Các thông tin thu thập được trong nghiên cứu này chỉ nhằm mục đích khoa học và phục vụ khám chữa bệnh mà không vì mục đích nào khác.
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu
• Đặc điểm về tuổi, giới:
Bảng 3.1. Đặc điểm về tuổi, giới
STT Tuổi Giới
M1 1 tháng tuổi Nữ
M2 2 tháng tuổi Nữ
M3 9 tháng tuổi Nam
M4 12 tuổi Nữ
• Các kết quả xét nghiệm cận lâm sàng:
Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh bằng MSMS
Chỉ số Mẫu M1 Mẫu M2 Khoảng tham
chiếu (µmol/l) Alanine 108,96 219,97 103-710 Aspartic 44,19 41,67 9-129 Citrulline 160,58 462,68 5,6-35 Glutamic acid 227,91 326,2 152-468 Glycine 213,18 109,16 67-740 Leucine 70,57 136,54 57-251 Lysine 180,68 379,81 95-320 Methionine 17,44 68,3 10-60 Ornithine 70,97 223,11 22-103
Nhận xét:
Kết quả từ Bảng 3.2 cho thấy:
- Có sự tăng của nhiều axit amin bao gồm citrulline, tyrosine, methionine và phenylalanine
- Trong đó citrulline máu tăng 2/2 mẫu
Bảng 3.3. Kết quả xét nghiệm sinh hóa máu
Tên xét nghiệm Mẫu M3 Khoảng tham chiếu Mẫu M4 Khoảng tham chiếu Đơn vị Định lượng Protein toàn phần 65,8 55-79 72 57-80 mmol/l Định lượng Albumin 40,4 28-48 40,1 39-49 g/l Cholesterol 4,85 1,71-5.91 5.03 2,88-5.23 mmol/l GOT 42,0 19-61 30,7 17-33 U/l GPT 19,9 6-50 20,3 5-40 U/l Gama GT 59,2 6-92 24,2 5-15 U/l Triglyceride 7,57 0,62-3,12 0,91 0,51-2,38 mmol/l Amoniac 28 < 85,2 31 < 170,3 µg/dl Lactat 1,70 1,1-2,3 1,40 0,6-0,9 mmol/l Tyrosine 220,85 221,49 14-108 Valine 124,29 145,44 52-190
Nhận xét:
• 2 mẫu M3 và M4 sử dụng khoảng tham chiếu khác nhau do khác nhau về độ tuổi cũng như giới tính.
• Kết quả từ Bảng 3.3 cho thấy:
- Ở mẫu M3 nhận thấy có sự tăng triglycerid.
- Mẫu M4, GGT tăng nhẹ ( < 2 lần so với giới hạn trên), tăng lactat máu.
Bảng 3.4. Kết quả xét nghiệm đông máu thời gian Prothrombin
Xét nghiệm Mẫu M3 Khoảng tham chiếu Mẫu M4 Khoảng tham chiếu PT (%) 112 70-140 99 70-140 PT (s) 10,2 13,1 11,0 11,2 PT (inr) 0,93 0,86-1,22 1,01 0,93-1,10 Nhận xét:
- Khoảng tham chiếu sử dụng cho 2 mẫu M3 và M4 là khác nhau do khác nhau về độ tuổi và giới tính
- Kết quả từ Bảng 3.4 cho thấy không có bất thường trong các chỉ số đông máu.
3.2. Kết quả xác định đột biến trên gen SLC25A13
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA
Các mẫu máu được thực hiện tách chiết DNA theo đúng quy trình và kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch trên máy quang phổ Fastgene NanoView. Kết quả thu được được thể hiện trong Bảng 3.5.
M1 18,5 0,369 1,808
M2 19,1 0,381 1,867
M3 35,9 0,719 1,892
M4 37,6 0,750 1,973
Nhận xét: Kết quả đo nồng độ DNA của 4 mẫu máu đều có nồng độ đạt
>10 ng/µl và có độ tinh sạch cao với tỷ số mật độ quang ở bước sóng 260/280 nm luôn nằm trong khoảng 1,8-2,0. Sản phẩm tách chiết DNA đủ điều kiện để tiến hành các bước tiếp theo.
3.2.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR
Mẫu DNA sau khi tách chiết được chạy phản ứng PCR theo các điều kiện