Xét nghiệm Mẫu M3 Khoảng tham chiếu Mẫu M4 Khoảng tham chiếu PT (%) 112 70-140 99 70-140 PT (s) 10,2 13,1 11,0 11,2 PT (inr) 0,93 0,86-1,22 1,01 0,93-1,10 Nhận xét:
- Khoảng tham chiếu sử dụng cho 2 mẫu M3 và M4 là khác nhau do khác nhau về độ tuổi và giới tính
- Kết quả từ Bảng 3.4 cho thấy không có bất thường trong các chỉ số đông máu.
3.2. Kết quả xác định đột biến trên gen SLC25A13
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA
Các mẫu máu được thực hiện tách chiết DNA theo đúng quy trình và kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch trên máy quang phổ Fastgene NanoView. Kết quả thu được được thể hiện trong Bảng 3.5.
M1 18,5 0,369 1,808
M2 19,1 0,381 1,867
M3 35,9 0,719 1,892
M4 37,6 0,750 1,973
Nhận xét: Kết quả đo nồng độ DNA của 4 mẫu máu đều có nồng độ đạt
>10 ng/µl và có độ tinh sạch cao với tỷ số mật độ quang ở bước sóng 260/280 nm luôn nằm trong khoảng 1,8-2,0. Sản phẩm tách chiết DNA đủ điều kiện để tiến hành các bước tiếp theo.
3.2.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR
Mẫu DNA sau khi tách chiết được chạy phản ứng PCR theo các điều kiện đã khảo sát, sau đó chạy điện di trên thạch Agarose 2%. Kết quả như Hình 3.1.
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA mẫu 01
Chú thích: 1.1-primer 1, 1.2-primer 2, 1.3-primer 3, 1.4-primer 4, 1.5-primer 5, 1.6-primer 6, 1.7-primer 7, 1.8-primer 8, 1.9-primer 9, 1.10-primer 10, 1.11-primer 11
Nhận xét: Hình ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu bệnh nhân thu được vạch sản phẩm sáng rõ, đơn băng, chiều dài sản phẩm phù hợp với lý thuyết và với mẫu DNA chứng.
3.1.1. Kết quả giải trình tự gen phát hiện đột biến gen SLC25A13
Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch được tiến hành chạy giải trình tự gen theo phương pháp Sanger. Kết quả thu được được phân tích kết quả trên phần mềm Unipro UGENE, so sánh với gen SLC25A13 tải về từ thư viện gen NCBI (Homo sapiens Updated Annotation Release 109.20191205, GRCh38.p13) tương tự như thực hiện với mẫu chứng.
Kết quả: trên cả 4 mẫu đều phát hiện được đột biến đồng hợp tử gen thuộc loại
đột biến số 11 (rs80338720, I(851.delGTAT))
(A)Mẫu chứng
(B)Mẫu bệnh chứa đột biến I - c.851delGTAT (p.Met285ProfsTer2)ở dạng đồng hợp tử
(A) (B)
hiện một peak đơn lẻ, kết quả tương tự với mẫu chứng (Hình 3.2A) và trình tự gen so sánh. Tại vị trí phát hiện đột biến số 11 (I(851.delGTAT) dạng đồng hợp tử (Hình 3.2B), hình ảnh cho thấy đoạn gen giải trình tự bị mất 4 nucleotide GTAT.
Chương 4 BÀN LUẬN BÀN LUẬN
Đột biến gen SLC25A13 lần đầu tiên được Keiko Kobayashi và cộng sự
phát hiện tại Nhật Bản vào năm 1999, bằng cách phân tích lập bản đồ đồng hợp tử của các bệnh nhân. Sử dụng nhân bản vị trí đã phát hiện 5 đột biến lần lượt là [I], [II], [III], [IV], [V]. Cho tới nay đã có hơn 50 kiểu đột biến gen SLC25A13
được phát hiện và công bố trên toàn thế giới với những đặc trưng theo từng vùng địa lý. Nhờ sự phát triển của sinh học phân tử mà nhiều kỹ thuật đã được được áp dụng để xác định đột biến gen SLC25A13 như PCR/RFLP, giải trình tự gen Sanger, giải trình tự gen thế hệ mới Next generation sequencing – NGS. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen Sanger để xác định các đột biến gen SLC25A13 gây bệnh thiếu hụt citrin ở trẻ em tại Việt Nam.
Sau khi tiến hành giải trình tự 4 mẫu thu được, kết quả phát hiện được đột biến I - c.851delGTAT (p.Met285ProfsTer2) xuất hiện ở dạng đồng hợp tử trên cả 4 mẫu bệnh nhân. Đột biến làm mất đoạn chứa 4 nucleotide GTAT tương ứng với codon 851-854 trên exon số 9, là đột biến dịch khung bắt đầu từ acid amin Methionin thứ 285. Sự thay đổi trình tự này dẫn đến tạo ra tín hiệu kết thúc dịch mã sớm trong gen SLC25A13 làm gián đoạn sự tổng hợp protein. Hậu quả là phân tử protein Citrin hình thành ngắn hơn bình thường. Do đó nó được phân loại vào đột biến gây bệnh làm mất chức năng gen. Về mặt tần suất phát hiện, đây là đột biến phổ biến nhất gây thiếu hụt citrin ở Trung quốc (chiếm 58.3 - 70%) và phổ biến thứ hai gây bệnh tại Nhật Bản (20%), kết quả tần suất phụ thuộc từng nghiên cứu. Tại Việt Nam, trong các nghiên cứu của Nguyễn Phạm Anh Hoa (2012), Bùi Đình Dương (2021), tần suất phát hiện loại đột biến này được báo cáo lần lượt là 95,3% (41/43) và 93,3% (14/15) so với tổng số alen mang đột biến, trong đó đột biến dạng đồng hợp tử chiếm 82,9% (34/41)
mẫu lớn hơn, có sự so sánh với mẫu người bình thường để có được cái nhìn tổng quan về tỷ lệ đột biến và đa hình trong quần thể ở người Việt Nam.
Khi nhìn lại các kết quả cận lâm sàng của 4 bệnh nhân, ta thấy rằng: với kết quả sàng lọc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh bằng MSMS ở 2 bệnh nhân M1 và M2, cho thấy nồng độ citrulline tăng cao trên cả 2 bệnh nhân; kết quả sinh hóa máu ở bệnh nhân M3 và M4, cho thấy ở M3 có tăng triglyceride, M4 có GGT tăng nhẹ; kết quả xét nghiệm đông máu của 2 bệnh nhân M3, M4 cho thấy không có bất thường trong các chỉ số. (Bảng 3.2, Bảng 3.3, Bảng 3.4)
Thiếu citrin ở bệnh nhân NICCD sẽ gây nên bất thường trong quá trình chuyển hóa các acid amin khiến nồng độ một số acid amin tăng trong máu, đặc biệt là nồng độ citrulline.
Trong một nghiên cứu của Fu Hai-yan và cộng sự (2013) khảo sát về đặc điểm của phổ acid amin trong huyết tương ở trẻ sơ sinh bị ứ mật trong gan do thiếu citrin nhằm xác định dấu hiệu sàng lọc của NICCD. Nghiên cứu thực hiện trên 182 trẻ sơ sinh và được chia làm 3 nhóm: 24 trẻ được chẩn đoán mắc NICCD, 20 trẻ được chẩn đoán thiểu sản đường mật (biliary atresia-BA), còn lại là nhóm được chẩn đoán viêm gan sơ sinh vô căn (idiopathic neonatal intrahepatic hepatitis-INH). Kết quả khi so sánh 3 nhóm này với nhau, thấy rằng nhóm NICCD có mức citrulline tăng đáng kể so với 2 nhóm còn lại (97,42 µmol/l so với 15,09 và 15,65) và khi giá trị của tỉ lệ Cit/Ala là 0,14 để chẩn đoán NICCD thì độ nhạy và độ đặc hiệu lần lượt là 75% và 95%. Kết luận là có thể sử dụng nồng độ citrulline và tỷ lệ Cit/Ala làm dấu ấn sàng lọc NICCD.21
Theo kết quả một nghiên cứu khác của CF Tang và cộng sự (2019), khi định lượng acid amin trong máu ở trẻ em thiếu hụt citrin cho thấy mức độ gia tăng của nhiều axit amin bao gồm citrulline, tyrosine, methionine và phenylalanine, và giảm tỷ lệ Ala/Cit. Sử dụng citrulline và tỷ lệ Ala/Cit làm chất đánh dấu sàng lọc có thể cải thiện giá trị tiên đoán dương tính với NICCD. Bệnh nhân được sàng lọc là dương tính với NICCD khi Cit tăng trên ngưỡng bình thường và tỷ lệ Ala/Cit ≤ 7,5.22 Đối chiếu với nghiên cứu này, cho thấy kết quả sàng lọc ở 2 bệnh nhân M1, M2 là phù hợp với trường hợp thiếu hụt citrin.
Chỉ số nồng độ citrulline máu tăng là một dấu ấn chỉ điểm quan trọng trong chẩn đoán bước đầu nghĩ đến bệnh lý thiếu hụt citrin. Tuy nhiên, nó cũng tăng trong một số bệnh khác, điển hình như Citrullinemia type 1 (CTLN1), là kết quả của sự thiếu hụt enzyme argininosuccinate nguyên phát được gây ra bởi các đột biến di truyền lặn trên NST thường.
Bệnh nhân M4 mang đột biến loại I đồng hợp tử, thuộc nhóm trên 1 tuổi, nếu dựa vào độ tuổi thì có thể xếp bệnh nhân vào giai đoạn FTTDCD. Với giai đoạn bệnh FTTDCD, các chỉ số sinh hóa như nồng độ citrulline, amoniac vẫn có thể nằm trong khoảng bình thường hoặc hơi tăng. Sự rối loạn lipid máu trong giai đoạn bệnh này được biểu hiện ở sự tăng nồng độ triglyceride, cholesterol trong máu.23 Đối chiếu với các kết quả cận lâm sàng cho thấy, ở bệnh nhân này hoạt độ enzym GGT tăng nhẹ (< 2 lần so với giới hạn trên), tuy nhiên định lượng triglyceride và cholesterol cho thấy nồng độ nằm trong khoảng giá trị bình thường, các xét nghiệm khác cũng bình thường, không cho thấy đặc điểm rối loạn lipid máu. Thông thường, bệnh nhân FTTDCD có đặc điểm kiểu hình là rối loạn mỡ máu, tuy nhiên không phải trường hợp bệnh nào cũng có đặc điểm này.
Như vậy, các kết quả cận lâm sàng như trên chỉ mang tính chất sàng lọc, nếu chỉ dựa vào các kết quả này thì chưa thể chẩn đoán được bệnh thiếu hụt citrin. Mà thay vào đó cần phải có các phân tích di truyền gen thì mới có thể xác định được bệnh.
Do đó phân tích gen SLC25A13 được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán bệnh thiếu hụt citrin.
KẾT LUẬN
Căn cứ vào các kết quả trên, chúng tôi xin được rút ra kết luận như sau:
Nghiên cứu đã phát hiện được 1 kiểu đột biến đồng hợp tử rs80338720 (I(851delGTAT)) trên tất cả 04 mẫu bằng phương pháp giải trình tự Sanger.
theo dõi sau điều trị bệnh thiếu citrin ở trẻ em. Luận Án Tiến Sĩ Học Chuyên Ngành Nhi Khoa. 2012.
2. Yasuda T, Yamaguchi N, Kobayashi K, et al. Identification of two novel mutations in the SLC25A13 gene and detection of seven mutations in 102 patients with adult-onset type II citrullinemia. Hum Genet.
2000;107(6):537-545.
3. Lu YB, Kobayashi K, Ushikai M, et al. Frequency and distribution in East Asia of 12 mutations identified in the SLC25A13 gene of Japanese patients with citrin deficiency. J Hum Genet. 2005;50(7):338-346.
4. Thangaratnarajah C, Ruprecht JJ, Kunji ERS. Calcium-induced conformational changes of the regulatory domain of human mitochondrial aspartate/glutamate carriers. Nat Commun. 2014;5(1):5491.
5. Grisar T, Lakaye B, Nijs L de, LoTurco JJ, Daga A, Delgado-Escueta AV.
Myoclonin1/EFHC1 in Cell Division, Neuroblast Migration, and Synapse/Dendrite Formation in Juvenile Myoclonic Epilepsy. Oxford
University Press; 2012.
6. Ruprecht JJ, Kunji ERS. The SLC25 Mitochondrial Carrier Family: Structure and Mechanism. Trends in Biochemical Sciences.
2020;45(3):244-258.
7. Saheki T, Kobayashi K, Iijima M, et al. Pathogenesis and pathophysiology of citrin (a mitochondrial aspartate glutamate carrier) deficiency. Metab Brain Dis. 2002;17(4):335-346.
8. Saheki T, Kobayashi K, Terashi M, et al. Reduced carbohydrate intake in citrin-deficient subjects. J Inherit Metab Dis. 2008;31(3):386-394.
9. Nakamura M, Yazaki M, Kobayashi Y, et al. The characteristics of food intake in patients with type II citrullinemia. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 2011;57(3):239-245.
with neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency (NICCD). Journal of Inherited Metabolic Disease. 2007;30(2):139-144. 11. Okamoto M, Okano Y, Okano M, et al. Food Preferences of Patients with
Citrin Deficiency. Nutrients. 2021;13(9):3123.
12. Ben-Shalom E, Kobayashi K, Shaag A, et al. Infantile citrullinemia caused by citrin deficiency with increased dibasic amino acids. Mol Genet Metab. 2002;77(3):202-208.
13. Saheki T, Kobayashi K. Mitochondrial aspartate glutamate carrier (citrin) deficiency as the cause of adult-onset type II citrullinemia (CTLN2) and idiopathic neonatal hepatitis (NICCD). J Hum Genet. 2002;47(7):333-341. 14. Wang LY, Chen NI, Chen PW, et al. Newborn screening for citrin deficiency and carnitine uptake defect using second-tier molecular tests.
BMC Medical Genetics. 2013;14(1):24.
15. Hayasaka K. Metabolic basis and treatment of citrin deficiency. J Inherit Metab Dis. 2021;44(1):110-117.
16. Hayasaka K, Numakura C, Watanabe H. Treatment and Pathomechanism of Citrin Deficiency. Brain Nerve. 2015;67(6):739-747.
17. Tạ Thành Văn. PCR và Một Số Kỹ Thuật y Sinh Học Phân Tử. Nhà xuất bản y học Hà Nội; 2010.
18. Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 1987;155:335-
350.
19. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain- terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977;74(12):5463-5467. 20. Bùi Đình Dương. Xác Định Đột Biến Gen SLC25A13 Gây Bệnh Thiếu Hụt
Citrin ở Trẻ Em. Đại học y Hà Nội; 2021.
21. Fu H yan, Wang X hong, Lu Y, et al. Characteristics of the plasma amino acid spectrum of neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 2013;21(12):934-939.
Tsukahara H, Ramirez F, Barber CL, Otsuka F, eds. Human Pathobiochemistry: From Clinical Studies to Molecular Mechanisms.
Phụ lục
CÁC KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM CẬN LÂM SÀNG
Đặc điểm tuổi, giới
STT Tên Tuổi Giới
M1 NTL 1 tháng tuổi Nữ
M2 HTH 2 tháng tuổi Nữ
M3 NVT 9 tháng tuổi Nam
M4 NNM 12 tuổi Nữ
Kết quả xét nghiệm sinh hóa
Chỉ số Mẫu M1 Mẫu M2 Mẫu M3 Mẫu M4
Alanine 108,96 219,97 N/A N/A
Aspartic 44,19 41,67 N/A N/A
Citrulline 160,58 462,68 N/A N/A
Glutamic acid 227,91 326,2 N/A N/A
Glycine 213,18 109,16 N/A N/A
Leucine 70,57 136,54 N/A N/A
Lysine 180,68 379,81 N/A N/A
Methionine 17,44 68,3 N/A N/A
Ornithine 70,97 223,11 N/A N/A
Valine 124,29 145,44 N/A N/A
Protein toàn phần N/A N/A 65,8 72
Albumin N/A N/A 40,4 40,1
Cholesterol N/A N/A 4,85 5.03
GOT N/A N/A 42,0 30,7
GPT N/A N/A 19,9 20,3
Gama GT N/A N/A 59,2 24,2
Triglyceride N/A N/A 7,57 0,91
Amoniac N/A N/A 28 31
Lactat N/A N/A 1,70 1,40
*N/A: không tìm thấy
Kết quả xét nghiệm đông máu thời gian prothrombin Xét nghiệm Mẫu M1 Mẫu M2 Mẫu M3 Mẫu M4
PT (%) N/A N/A 112 70-140
PT (s) N/A N/A 10,2 11,2
Chỉ số Mẫu M1 Mẫu M2 Mẫu M3 Mẫu M4
WBC N/A N/A 9,99 6,78
%NEU N/A N/A 17,0 47,2
%LYM N/A N/A 71,7 41,6
%MO N/A N/A 7,5 8,2
%EO N/A N/A 1,2 2,6
%BA N/A N/A 2,6 0,4
NEUT N/A N/A 1,70 3,2
LYM N/A N/A 7,17 2,82
MO N/A N/A 0,75 0,56 EO N/A N/A 0,12 0,18 BA N/A N/A 0,26 0,03 RBC N/A N/A 3,88 4,62 HGB N/A N/A 116 135 HCT N/A N/A 34,2 40,3 MCV N/A N/A 88,1 87,2 MCH N/A N/A 30,0 29,2 MCHC N/A N/A 341 335 RDW-CV N/A N/A 13,5 13,8 PLT N/A N/A 233 212 MPV N/A N/A 8,2 8,8 PDW N/A N/A 17,22 17,59 PCT N/A N/A 0,1902 0,1865