a. Nguyên tắc
Kỷ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chaamjqua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được giải hấp ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ.
b. Thực hành • Dụng cụ và thiết bị - Phễu đổ gel - Bình hút chân không - Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30*1.5 cm, thể tích: 53 ml. - Bình đựng dung dịch đệm
- Ống nghiệm 20 cái vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch.
• Hóa chất - Gel “Sephadex G-100”.
- Đệm Acetate 50 mM pH5, đuổi bọt khí để tách enzyme tốt hơn.
• Chuẩn bị gel
- Cân 5g gel “Sephadex G-100” khô, cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm acetate 50Mm, pH 5.0 đựng trong cốc. Dùng dung dịch đệm acetate pH 5.0 nhiều gấp 2 lần so với thể tích lớp nền gel cần cho trong cột. Cụ thể dùng ít nhất 53*2=106 ml dung dịch đệm.
- Sau khi quá trình hydrat hóa xãy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển dung dịch vào một bình nút hút chân không có gắn với vòi hút chân không. Khử khí của dung dịch trong khoảng từ 5 phút-10 phút,
thỉnh thoảng lắc nhẹ bình. Không dùng đũa khuấy vì nó có thể làm hư gel.
- Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp 2 lần thể tích lớp nền và lắc nhẹ. Để gel ổn định cho đến khi 90% - 95% số hạt ổn định. Gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại hơn 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel.
- Gắn phiểu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột.
- Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bẩn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí.
- Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2-5cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel.
- Khi cột đã nạp đầy gel, khóa đầu ra của cột và gắn flow adaptor. Mở khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đện với thể tích gấp 2 lần thể tích lớp nền chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy.
- Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor. Nếu tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm không nên vượt quá tốc độ dòng tách đề nghị.
• Chuẩn bị mẫu
- Hòa tan hoàn toàn protein trong dung dịch đệm, sau đó tiến hành lọc. Vì mẫu chạy sắc ký phải sạch.
- Lọc mẫu qua milipore sẽ làm gia tăng độ bền /thời gian sử dụng của cột.
Hình 10: lọc gel.
• Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 280 nm.
Số ống 1 2 3 4 5 6 7 8 OD 0.01 3 0.03 0.05 0.021 0.01 7 0.019 0.01 8 0.016 c. Vẽ đồ thị:
Dựa vào chỉ số OD ta vẽ được đồ thị sau:
Trong 8 ống nghiệm trên ta lấy từ ống số 2 đến ống số 8, trộn chung lại để xác định hàm lượng protein sau sắc ký và họat tính enzeme sau sắc ký.