3.4.1 Chuẩn bị chất chuẩn
Để chuẩn bị chất chuẩn, 5 ống propylen eppendorf 1,5 mL phải được đặt trên giá và đánh số.
Mỗi loại trong số này phải được thêm một chất pha loãng với lượng được xác định.
Dùng pipet tự động lấy nồng độ thích hợp của chất chuẩn gốc, thêm vào ống 5 và trộn bằng máy xoáy trong khoảng 10 giây.
Nồng độ thích hợp của tiêu chuẩn số 5 này phải được lấy bằng pipet tự động có đầu đã được thay đổi và đưa vào ống 4.
Quá trình này phải được lặp lại cho đến ống 1, sử dụng đầu pipet mới trong mỗi lần chuyển, và các chất chuẩn nên được chuẩn bị thông qua quá trình pha loãng nối tiếp.
3.4.2 Chuẩn bị dung dịch rửa
Để pha loãng 50 mL dung dịch rửa đậm đặc gấp 20 lần do công ty sản xuất cung cấp, nên cho 950 mL nước cất vào bình. Sau đó, thêm 50 mL dung dịch rửa đậm đặc 20 lần vào nước cất, bạn có thể có dung dịch rửa đậm đặc gấp 1 lần.
3.4.3 Các bước phân tích
- Cần bổ sung một lượng thích hợp đệm EIA vào các giếng NSB.
- Cần thêm lượng thích hợp dung dịch tiêu chuẩn vào các giếng tiêu chuẩn; - Một lượng thích hợp của các giải pháp kiểm soát chất lượng liên quan phải được đặt trong các giếng đối chứng 1 (QC1) và QC2.
- Các giếng mẫu phải được bổ sung các chất pha loãng mẫu liên quan.
- Tất cả các giếng trừ giếng mù phải được bổ sung một lượng kháng thể sơ cấp. - Đĩa phải được phủ bằng parafilm và để ủ ở nhiệt độ phòng trong một thời gian.
- Tất cả các giếng phải được rửa trong máy rửa ELISA sử dụng một lượng đệm rửa thích hợp.
- Mẫu được lắc bằng máy lắc quỹ đạo (350 vòng/phút) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
- Rửa trong máy rửa ELISA với đệm rửa như được hướng dẫn trên danh mục. - Cần thêm một lượng nhất định peptit được đánh dấu biotin vào tất cả các giếng, ngoại trừ mẫu trắng.
- Đĩa phải được phủ bằng parafilm và để ủ ở nhiệt độ phòng trong một khoảng thời gian được nêu trên danh mục.
- Cần gỡ bỏ lớp parafilm trên đĩa và làm sạch chất chứa trong giếng.
- Rửa lại trong máy rửa ELISA sử dụng dung dịch đệm rửa, sau đó sẽ được loại bỏ.
- Dung dịch SA-HRP nên được thêm vào tất cả các giếng.
- Đĩa phải được phủ bằng parafilm một lần nữa và để ủ trong máy lắc quỹ đạo (350 vòng/phút) ở nhiệt độ phòng trong một thời gian nhất định.
- Sau khi loại bỏ parafilm trên đĩa, tất cả các giếng phải được rửa trong máy rửa ELISA sử dụng một lượng đệm rửa thích hợp.
- Dung dịch TMB nên được thêm vào tất cả các giếng, sau đó sẽ được ủ. Ở giai đoạn này, đĩa nên được che để tránh ánh sáng.
- Đĩa sẽ được phủ parafilm một lần nữa và ủ.
- Cần loại bỏ parafilm và thêm axit (HCl 2N) vào từng giếng để dừng phản ứng. Sau khi thêm dung dịch dừng, màu xanh lam sẽ bắt đầu chuyển sang màu vàng.
Ngay sau khi thêm dung dịch dừng, phải đọc kết quả trong vòng 10 phút ở bước sóng 450 nm. Trước khi đọc, nồng độ của các chất chuẩn phải được nhập vào máy đọc ELISA. Do đó, thiết bị có thể vẽ đồ thị đường cong tiêu chuẩn và tự động tính toán nồng độ của các mẫu. Tính toán này có thể được in ra.
Trong phòng thí nghiệm của chúng tôi, một thiết bị ELISA ELX800 được sử dụng để đọc Bộ đọc, máy in và vòng đệm được sử dụng trong phương pháp ELISA được trình bày trong hình 3.7.
Hình 3.7 Máy rửa (a), đầu đọc kết quả (b) và máy in (c) được sử dụng trong quy trình ELISA
3.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp ELISA (Sakamoto S. và cộng sự, 2017)3.5.1 Ưu điểm 3.5.1 Ưu điểm
- Quy trình thực hiện đơn giản - Độ đặc hiệu và độ nhạy cao - Hiệu quả cao
- Có thể phân tích đồng thời mà không cần xử lý trước mẫu phức tạp - An toàn và thân thiện với môi trường
- Giá thành thấp.
3.5.2 Nhược điểm
- Sử dụng nhiều lao động và tốn kém trong việc chuẩn bị kháng thể - Yêu cầu kỹ thuật phức tạp và môi trường nuôi cấy đắt tiền - Khả năng dương tính/âm tính giả cao
- Việc ngăn chặn không đủ kháng nguyên cố định dẫn đến kết quả sai - Kháng thể không ổn định
CHƯƠNG 4: PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) 4.1 Nguyên tắc (Nassonova E. S., 2008)
Điện di trên gel trường xung (PFGE) là một kỹ thuật cho phép tách các phân tử DNA trong gel agarose bằng cách sử dụng hai điện trường xen kẽ, với các vectơ hướng tới nhau ở góc tù.
PFGE phân đoạn các phân tử DNA lớn có kích thước từ 10 kb đến 10 Mb. Trong phạm vi này là DNA nhiễm sắc thể của sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân thực bậc thấp; do đó, có thể điều khiển DNA của toàn bộ nhiễm sắc thể hoặc các đoạn lớn của chúng (đối với sinh vật bậc cao). Đó là lý do mà kỹ thuật này là một công cụ quan trọng trong hệ gen hiện đại.
Hình 4.1 Sơ đồ thể hiện cơ chế phân đoạn DNA trong quá trình điện di trên gel trường xung
Khi chuyển đổi điện trường, các phân tử DNA đầu tiên bắt đầu chuyển động ngược lại trong gel được dẫn đầu bởi các đuôi trước của chúng. Mỗi phân tử di chuyển về phía sau một khoảng tỷ lệ với kích thước (a), (b) của nó. Sau đó, các phân tử bắt đầu chuyển động trong một trường mới (c). Kết quả là, các phân tử dài hơn nằm sau các phân tử ngắn hơn. Với mỗi chuyển đổi trường mới, sự chậm lại của các phân tử dài
hơn trở nên sâu sắc hơn (d), (e), (f). E1, E2 là vectơ cường độ điện trường; các mũi tên dài và ngắn lần lượt cho biết các phân tử DNA dài và ngắn. Các đầu mũi tên cho biết hướng di chuyển của các phân tử và do đó, vị trí của các đầu cuối của chúng. Các đường đứt nét hiển thị các dấu vết của sự di chuyển phân tử trong gel.
4.2 Thiết bị và quy trình thực hiện (Nassonova E. S., 2008)
Điện trường được chuyển đổi trong những khoảng thời gian nhất định ở một góc 90°.
Gel được đặt vào buồng để điện di ngang. Một điện trường là đồng nhất và được tạo ra bởi hai hàng điểm điện cực. Trường còn lại là không đồng nhất và được tạo ra bởi một số điểm điện cực làm cực âm và một điểm điện cực làm cực dương. Hệ thống này được gọi là “điện di gradient trường xung” (PFGE).
Hình 4.2 Giản đồ thể hiện hình dạng điện cực trong các dụng cụ thường dùng cho điện di gel trường xung
Các tác giả coi gradient điện thế là điều kiện tiên quyết để các phân tử DNA được tách ra trong trường xung. Do đó, họ đã sử dụng các cấu hình điện cực cuối cùng tạo ra
một trường không đồng nhất. Trong hệ thống này, góc giữa các vectơ cường độ trường thay đổi ở các vùng gel khác nhau (110° –150°).
Các phân tử có kích thước bằng nhau di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào vị trí ban đầu của chúng trong gel; điều này làm phức tạp việc so sánh các di động điện di của các DNA chạy trên các làn đường viền khiến không thể ước tính chính xác kích thước.
4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp (Nassonova E. S.,2008) 2008)
4.3.1 Thời gian xung (thời gian chuyển đổi, khoảng thời gian chuyển đổi)
Thời gian xung là khoảng thời gian chuyển hướng của trường. Các thí nghiệm đầu tiên về phân đoạn ADN trong điện trường xung cho thấy thời gian xung là thông số quan trọng nhất để phân tách phân tử.
Kích thước của các phân tử phân đoạn càng lớn thì việc chuyển đổi điện trường càng ít.
Với một thời gian xung nhất định, chỉ các phân tử thuộc một loại kích thước cụ thể mới xuất hiện trong điều kiện tối ưu để tách và có thể được phân đoạn một cách hiệu quả. Do đó, để phân đoạn DNA trong một phạm vi kích thước rộng, cần phải tìm ra chế độ tăng tuần tự của thời gian xung.
Hình 4.3 Ví dụ về phân đoạn và xác định kích thước của DNA nhiễm sắc thể bằng điện di trên gel trường xung với đoạn dốc thời gian xung
Sự thay đổi của thời gian xung trong quá trình điện di được gọi là “tăng dần”. Tham số này có thể được tăng lên trong suốt quá trình chạy liên tục hoặc không liên tục trên một phạm vi giá trị rời rạc. Sự gia tăng liên tục của thời gian xung từ nhỏ nhất đến lớn nhất của các giá trị xác định trong một khoảng thời gian nhất định được gọi là "nội suy". Một biến thể thay thế, thời gian xung tăng lên từng bước, được gọi là "bước".
Sự phân giải phân tử trong gel được đặc trưng bởi khoảng cách dải và độ sắc nét của dải. Vùng trong gel nơi đạt được hiệu quả phân tách DNA được gọi là “vùng phân giải” hay “cửa sổ phân giải”. Sự phụ thuộc giữa tốc độ di chuyển DNA và kích thước phân tử là tuyến tính trong vùng phân giải; do đó, có thể ước tính chính xác kích thước của các phân tử DNA trong vùng này.
4.3.2 Cường độ trường
Độ phân giải là hàm của cả thời gian xung và cường độ điện trường. Nhìn chung, cường độ trường càng cao thì tốc độ di chuyển phân tử càng cao. Tuy nhiên, kích thước phân tử càng cao thì sự phụ thuộc này càng lệch khỏi hàm tuyến tính.
Để tách các phân tử nhỏ hơn 1 Mb, cường độ trường áp dụng là 6 –10 V/cm. Cường độ trường càng thấp, độ phân giải càng cao; tuy nhiên, phạm vi kích thước của các phân tử được phân tách hẹp hơn.
Cường độ trường cao quá mức (cao hơn 10 V/cm) dẫn đến sự phân tách phân tử yếu và xuất hiện cái gọi là “vết bẩn”, tức là các vùng nhuộm DNA đồng nhất với các dải đơn không xác định bằng mắt thường.
Đối với các phân tử lớn (hơn 1 Mb), cường độ trường cao dẫn đến “hiệu ứng bẫy”, tức là sự cố định phân tử vĩnh viễn tự phát trong gel do những thay đổi cụ thể không thể đảo ngược của cấu trúc của chúng. Các phân tử như vậy được ưu tiên phân đoạn ở cường độ trường thấp (1–3 V/cm).
Thời gian xung và cường độ trường là các yếu tố có liên quan lẫn nhau. Độ phân giải PFGE được xác định bằng “hàm Window” sau:
W = E1,4 × Tp
Trong đó E là cường độ điện trường và Tp là thời gian xung.
Giá trị của hàm càng cao, kích thước của các phân tử DNA càng lớn để có thể phân tách hiệu quả. Rõ ràng là có thể đạt được sự phân tách các phân tử DNA có cùng dải kích thước với thời gian xung khác nhau nếu cường độ trường được thay đổi sao cho giá trị hàm W không đổi.
4.3.3 Định hướng lại góc
Tham số này trong một số thiết bị PFGE là cố định. Ở những thiết bị khác, nó thay đổi từ 90 đến 180°. Người ta chứng minh rằng sự thay đổi của góc định hướng lại không ảnh hưởng đáng kể đến sự di chuyển của các phân tử nhỏ hơn 1 Mb. Độ linh động của các phân tử lớn hơn tăng khi góc giảm; tuy nhiên, độ phân giải dải trong gel ngày càng giảm. Theo kinh nghiệm, người ta thấy rằng sự phân tách tốt nhất đạt được với giá trị góc hơn 110°. Hầu hết các dụng cụ thương mại có sẵn cho PFGE sử dụng một góc cố định 120°.
4.3.4 Nồng độ agarose trong gel
Nồng độ agarose trong gel ít ảnh hưởng đến tính di động của các phân tử DNA trong quá trình điện di trong trường xung hơn là trong trường không đổi.
Người ta thấy rằng độ phân giải có phần tốt hơn đối với gel agarose 1,2% so với gel 0,9%. Việc tăng thêm nồng độ agarose chỉ làm giảm tính linh động và do đó làm
tăng thời gian chạy mà không cải thiện độ phân giải. Trong thực tế, để tách các phân tử có kích thước nhỏ hơn 3 Mb, gel agarose 1,0–1,5% thường được sử dụng.
4.3.5 Thành phần và nhiệt độ của đệm điện di
Bộ đệm có độ bền ion cao, Tris-borate (0,5 × TBE) hoặc Tris-acetate (1 × TAE) thường được sử dụng cho PFGE.
Tính linh động điện di của các phân tử DNA trong trường xung phụ thuộc mạnh mẽ vào nhiệt độ đệm. Nhiệt độ càng cao, tốc độ di chuyển phân tử càng cao.
PFGE thường được thực hiện ở 12–16°C. Ở nhiệt độ đệm cao hơn, các dải trở nên rộng và khuếch tán. Nó làm giảm đáng kể độ phân giải và sự xuất hiện của vết bẩn.
4.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp (Olive D. M., 1999)4.4.1 Ưu điểm 4.4.1 Ưu điểm
PFGE đã được chứng minh là vượt trội so với hầu hết các phương pháp khác để phân tích sinh hóa và phân tử. Nó có tính phân biệt cao và ưu việt hơn hầu hết các phương pháp phân tích Escherichia coli, enterococci kháng vancomycin, S. aureus,
loài Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa M. aviumvà .
PFGE hiệu quả hơn trong việc phân biệt các chủng S. aureus kháng methicillin so với các phương pháp khác được thử nghiệm.
PFGE cũng có tính phân biệt cao hơn so với PCR dựa trên trình tự yếu tố lặp lại (Rep-PCR) để phân biệt các chủng của Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii phức hợp, cầu khuẩn ruột kháng vancomycin, Neisseria gonorrhoeae và P. aeruginosa.
4.4.2 Nhược điểm
Một trong những yếu tố đã hạn chế việc sử dụng PFGE là thời gian hoàn thành phân tích. Mặc dù các bước thủ tục đơn giản nhưng thời gian cần thiết để hoàn thành thủ tục có thể từ 2 đến 3 ngày. Điều này có thể làm giảm khả năng phân tích số lượng lớn mẫu của phòng thí nghiệm.
CHƯƠNG 5: SẮC KÝ KHÍ 5.1 Nguyên tắc của sắc ký khí (Al-Bukhaiti W. Q., 2017)
Cơ sở của sự phân tách là sự chậm lại của các thành phần riêng lẻ khi chúng được di chuyển qua một cột dài bởi khí mang, thường là heli hoặc nitơ.
Cột bao gồm một ống thép hoặc thủy tinh chứa đầy vật liệu đóng gói trơ như thủy tinh hoặc hạt gốm.
Hình 5.1 Sơ đồ của hệ thống sắc ký khí
Trong sắc ký khí-lỏng (GLC), chúng được phủ một lớp chất lỏng dễ bay hơi, do đó diện tích bề mặt của chất lỏng tiếp xúc với khí là lớn.
Đối với một số ứng dụng, bao bì có thể là chất rắn mà không có bất kỳ lớp phủ chất lỏng nào được gọi là sắc ký khí-rắn (GSC), nhưng phương pháp này ít được sử dụng rộng rãi hơn GLC.
Mẫu được bơm vào dòng khí mang. Khi nó di chuyển qua cột với khí mang, các phân tử của mỗi chất có trong mẫu sẽ phân bố giữa chất khí và chất lỏng. Các phân tử riêng lẻ sẽ liên tục chuyển động giữa chất khí và chất lỏng ở trạng thái cân bằng động. Khi một phân tử ở trong pha khí, nó sẽ đi dọc theo cột, trong khi vẫn hòa tan trong chất lỏng, nó sẽ đứng yên. Một chất càng dễ bay hơi, thì tỷ lệ thời gian các phân tử của nó chuyển động trong khí mang càng lớn, và do đó, nó sẽ ra khỏi cột càng sớm. Bằng cách này, mỗi chất sẽ tách ra trong cột và tách ra theo thời gian ở cuối.
Thời gian từ khi tiêm đến khi peak hiện lên được gọi là thời gian lưu (Rt), và đặc trưng cho từng chất trong bất kỳ tập hợp điều kiện nhất định nào. Nó phụ thuộc vào độ bay hơi của chất, cũng như nhiệt độ của cột và chiều dài và đường kính của nó. Nhiều chất có thời gian lưu giữ lâu ở nhiệt độ phòng một cách bất tiện và điều này được khắc phục bằng cách nung cột trong lò.
Sau khi tách các thành phần trong cột để chúng nổi lên riêng lẻ, cần có một số phương pháp phát hiện và đo lường chúng. Hai loại detector thường được sử dụng: dẫn nhiệt và ion hóa ngọn lửa.
Máy dò độ dẫn nhiệt (TCD) dựa trên sự thay đổi độ dẫn nhiệt của khí rời khỏi