Nghiín cứu q trình dị hóa trong tế băo, theo truyền thống, thường được bắt đầu bằng việc tìm hiểu câc q trình lín men, hay hơ hấp trong điều kiện kỵ khí, mă cơ sở của nó lă q trình glycolys , trong đó bao gồm một trật tự câc phản ứng phđn giải glucose thănh acid pyruvic. Truyền thống năy có ba lý do: Thứ nhất lă cơ thể sống có lẻ xuất hiện trín Trâi đất văo lúc mă bầu khí quyển khơng có oxy, nín hơ hấp kỵ khí được xem lă dạng đơn giản nhất của cơ chế sinh học cho phĩp thu nhận năng lượng từ câc chất dinh dưỡng. Thứ hai lă đa số những cơ thể hiếu khí tồn tại ngăy nay đều cịn giữ được khả năng tích lũy năng lượng lấy từ glucose bằng phương phâp đơn giản năy với tư câch lă giai đoạn chuẩn bị để oxy-hóa tiếp tục câc sản phẩm hình thănh trong giai đoạn năy trong điều kiện có oxy. Thứ ba lă câc giai đoạn phản ứng enzyme của quâ trình phđn hủy glucose trong điều kiện kỵ khí vă cơ chế tích lũy năng lượng trong q trình năy đê được hiểu biết khâ chi tiết.
Với những lý do đó glycolys có thể lă một mơ hình quan trọng để nghiín cứu câc q trình phức tạp hơn.
1. Glycolys lă cơ sở của câc q trình lín men.
Tất cả câc cơ thể dị dưỡng đều thu nhận năng lượng từ câc phản ứng oxy-hóa khử. Trong q trình lín men (hơ hấp kỵ khí) vai trò của chất nhận điện tử cuối cùng được thực hiện bởi một phđn tử hữu cơ năo đó hình thănh trong q trình lín men. Như vậy, lín men lă một q trình oxy-hóa khử nội bộ. Mức độ oxy-hóa tổng quât của sản phẩm oxy-hóa trong q trình năy khơng khâc với mức độ oxy-hóa của câc chất bị lín men.
Trong số nhiều kiểu lín men mă cơ chất lă glucose, quan trọng nhất lă hai kiểu lín men có quan hệ chặt chẽ với nhau sau đđy:
- Lín men lactic dẫn đến sự hình thănh hai phđn tử acid lactic từ một phđn tử glucose. Kiểu lín men năy đặc trưng cho nhiều vi sinh vật vă tế băo của động vật bậc cao, kể cả động vật có vú.
- Lín men rượu dẫn đến sự hình thănh hai phđn tử ethanol vă hai phđn tử CO2 từ một phđn tử glucose.
Cả hai kiểu lín men năy đều xảy ra với sự xúc tâc của hệ enzyme glycolys. Sự khâc nhau giữa chúng chỉ thể hiện ở giai đoạn cuối cùng, sau khi hình thănh acid pyruvic. Trong lín men lactic acid pyruvic bị khử thănh acid lactic, cịn trong lín men rượu phản ứng năy được thay bằng hai phản ứng khâc để dẫn đến sự hình thănh ethanol vă CO2 .
Mặc dù trong cả hai q trình lín men năy đều khơng có sự tham gia của oxy phđn tử, song trong chúng đều xảy ra câc phản ứng oxy-hóa khử. Chính vì vậy mă trong hai sản phẩm của q trình lín men rượu CO2 lă chất có mức độ oxy-hóa cao hơn, cịn ethanol - có mức độ khử cao hơn; hoặc trong acid pyruvic - sản phẩm cuối cùng duy nhất của q trình lín men lactic, một đầu mức độ khử cao, còn đầu kia có mức độ oxy-hóa cao. Trong khi đó ở hợp chất ban đầu (glucose) câc nguyín tử hydro được phđn bố đều đặn hơn.
Đặc điểm quan trọng thứ hai của hai quâ trình lín men năy, hay nói chung, của glycolys lă chúng kỉm theo tổng hợp ATP từ ADP vă phosphate vơ cơ. Nếu khơng có câc phản ứng phosphoryl-hóa ADP đồng thời năy thì glycolys vă lín men nói chung khơng thể xảy ra.
Phương trình tổng quât của lín men lactic vă lín men rượu có thể viết dưới dạng sau:
- Lín men lactic:
C6H12O6 + 2 ADP + 2 Pi –––> 2 CH3 -CHOH-COOH + 2 ATP + 2H2O - Lín men rượu:
C6H12O6 + 2 ADP + 2 Pi ––––> 2 CH3 -CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP + 2H2O Để phđn tích sự biến thiín năng lượng của glycolys, ta tâch q trình tổng qt trín đđy thănh hai bộ phận: chuyển hóa glucose thănh acid lactic (quâ trình giải phóng năng lượng) vă tổng hợp ATP từ ADP vă Pi (quâ trình hấp thu năng lượng):
Glucose ––––> 2 Lactate,
2 ADP + 2 Pi ––––> 2 ATP
∆Go'2 = 2 x 7,3 = 14,6 Kcal/mol. Từ đó biến thiín năng lượng tự do tổng số của glycolys lă
∆Go' S = ∆Go'1 + ∆Go'2 = -47,0 + 14,6 = -32,4 Kcal/mol
Từ câc số liệu năy có thể thấy rằng sự phđn giải glucose thănh acid lactic kỉm theo giải phóng một số năng lượng thừa để phosphoryl-hóa ADP thănh ATP. Có thể tính được một câch dễ dăng rằng trong hai phđn tử ATP năy tích lũy được 14,6 x 100/47,0 = 31% năng lượng tự do giải phóng khi phđn giải glucose thănh acid lactic. Con số năy thu được với nồng độ 1,0M. Nếu lưu ý đến nồng độ thực của câc chất tham gia phản ứng vă sản phẩm của phản ứng trong tế băo, thì hiệu suất của glycolys cịn có thể lớn hơn. Nếu trừ đi số năng lượng đê tích lũy trong hai phđn tử ATP, năng lượng tự do của glycolys vẫn còn giảm 32,4 Kcal. Điều năy cho thấy tại sao trín thực tế lă q trình khơng thuận nghịch, mă trạng thâi cđn bằng lệch hẵn về phía hình thănh acid lactic. Tuy nhiín, đa số giai đoạn của q trình năy đều có giâ trị biến thiín năng lượng tự do khơng lớn, vă do đó chúng lă những phản ứng thuận nghịch. Chiều ngược của những phản ứng năy được tế băo sử dụng trong việc tổng hợp lại glucose từ acid lactic.
2. Câc phản ứng của glycolys.
Tập hợp câc phản ứng kế tiếp nhau của glycolys được xem lă giai đoạn đầu tiín trong số 5 giai đoạn của q trình hơ hấp hiếu khí. Tồn bộ q trình glycolys xảy ra trong băo tương vă có thể chia lăm hai giai đoạn như mơ tả trong hình 11.
Ở giai đoạn 1 glucose được phosphoryl-hóavă sau đó bị phđn giải thănh hai phđn tử glyceraldehyde-3-phosphate. Ở giai đoạn 2 glyceraldehyde-3-phosphate chuyển hóa thănh acid pyruvic. Nếu q trình xảy ra trong điều kiện kỵ khí thì, như ta đê biết, acid pyruvic tiếp tục chuyển hóa thănh acid lactic hoặc ethanol. Giai đoạn thứ nhất được xem như giai đoạn chuẩn bị. Ở giai đoạn năy mọi hexose đều được lơi cuốn văo q trình glycolys bằng câch được phosphoryl-hóa nhờ ATP để sau đó tạo ra sản phẩm chung lă glyceraldehyde-3-phosphate. Giai đoạn thứ hai bao gồm câc phản ứng oxy-hóa - khử vă cơ chế tích lũy năng lượng, trong đó ADP được phosphoryl-hóa thănh ATP.
Tồn bộ q trình glycolys bao gồm ba kiểu phản ứng hóa học mă câc con đường của chúng liín quan mật thiết với nhau:
Glucose Glycogen, tinh bột ATP Pvc
Glucoso-1-phosphate ADP
Tích lũy câc dạng Glucoso-6-phosphate đường đơn giản vă
chuyển hóa chu Fructoso-6-phosphate thănhvglycer- aldehyde ATP 3-phosphate ADP Fructoso-1,6-diphosphate 2 (Glyceraldehyde-3-phosphate) 2 NAD+ Pvc 2 (1,3-Diphosphoglycerate) 2 ADP 2 NAD.H 2ATP 2 (3-Phosphoglycerate) Oxyhóa khử vă tồng hợp ATP; 2 (2-Phosphoglycerate) Hình thănh
acid lactic 2 (Phosphoenolpyruvate) 2 ADP 2 ATP 2 (Pyruvate) 2NAD+ 2(Lactate)
Hình 11: Sơ đồ tổng quât của quâ trình glycolys
1/ Phản ứng phđn giải bộ khung carbon của glucose thănh acid pyruvic (con đường của câc nguyín tử carbon);
2/ Phản ứng mă trong đó phosphate vơ cơ trở thănh nhóm phosphate tận cùng của phđn tử ATP (con đường của câc nhóm phosphate);
3/ Phản ứng oxy-hóa - khử (con đường vận chuyển điện tử). * Câc phản ứng của giai đoạn I.
1/ Phosphoryl-hóa D-glucose. Mg2+
α-D-Glucose + ATP ––––> α -D-Glucoso-6-phosphate + ADP ∆Go' = -4Kcal/mol
Phản ứng năy được xem như phản ứng khởi động của glycolys, trong đó phđn tử glucose kĩm hoạt động nhận gốc phosphate tận cùng của ATP vă phđn bố lại điện tử trong câc liín kết, nhờ đó được hoạt hóa ở dạng glucoso-6-phosphate để có thể tham gia văo câc chuyển hóa tiếp theo. Trong số 7,3Kcal do ATP cung cấp, 4,0 Kcal được giải phóng ở dạng nhiệt, cịn 3,3Kcal được tích lũy ở dạng hóa năng trong phđn tử glucoso-6-phosphate hoạt động.
Xúc tâc phản ứng lă câc enzyme hexokinase vă glucokinase mă chúng ta đê được lăm quen trong mục trước. Do năng lượng tự do giảm đâng kể, nín phản ứng chỉ xảy ra theo chiều thuận. Quâ trình ngược lại được xúc tâc bởi một enzyme khâc - α-D-glucoso-6-phosphatase:
α-D-Glucoso-6-phosphate + H2O ––> α-D-Glucose + P i
∆Go ' = -3,3 Kcal/mol.
2/ Chuyển hóa glucoso-6-phosphate thănh fructoso-6-phosphate.
α-D-Glucoso-6-(P) –––> β-D-Fructoso-6-(P)
∆Go' = + 0,4Kcal/mol
Phản ứng đồng phđn hóa năy được thực hiện nhờ enzyme phosphoguco- isomerase. Nó dễ dăng xảy ra theo cả hai chiều. Trong glycolys mặc dù phản ứng thuận có ∆Go' > 0 song vẫn xảy ra được lă nhờ giâ trị đm của phản ứng trước đó. Biến thiín năng lượng tự do tiíu chuẩn của cả hai phản ứng (1) vă (2) gộp lại vẫn còn giâ trị đm (-3,6Kcal/mol).
3/ Phosphoryl-hóa fructoso-6-phosphate thănh fructoso-1,6-diphosphate. Mg2+
β-D-Fructoso-6-(P) + ATP –––> β-D-Fructoso-1,6-di(P) + ADP ∆Go' = -3,4Kcal/mol
Phản ứng năy được xem lă phản ứng khởi động thứ hai, trong đó sử dụng thím một phđn tử ATP để phosphoryl-hóa fructoso-6-phosphate ở vị trí C-1. Trong số 7,3Kcal của ATP 3,9Kcal được tích lũy lại, cịn 3,4Kcal được giải phóng. Nếu cộng ∆Go' của cả 3 phản ứng, ta có giâ trị -7,0Kcal, tức K'eq của cả 3 phản ứng > 105 .
Phosphoryl-hóa fructoso-6-phosphate lă giai đoạn rất quan trọng, vì sự điều hịa q trình glycolys được thực hiện thơng qua điều hịa hoạt tính của enzyme phospho-fructokinase xúc tâc phản ứng năy. Hoạt tính của nó bị ức chế bởi ATP vă citrate (ở nồng độ cao) vă được kích thích bởi ADP vă AMP.
Giâ trị đm cao của ∆Go' cho thấy phản ứng trong tế băo không thể xảy ra theo chiều ngược. Phản ứng ngược được xúc tâc bởi một enzyme khâc. Đó lă diphospho- fructosophosphatase:
Fructoso-1,6-di(P) + H2O ––> Fructoso-6-(P) + Pi
4/ Phản ứng phđn giải fructoso-1,6-diphosphate thănh glyceraldehyde-3- phosphate vă dioxyacetonephosphate:
D-Fructoso-1,6-di(P) ––> Dioxyacetone-(P) + Glyceraldehyde-3-(P) ∆Go' = +5,73Kcal/mol
Phản ứng được xúc tâc bởi enzyme aldolase. Do ∆Go' có giâ trị dương khâ cao nín rất khó hình dung rằng phản ứng có thể xảy ra theo chiều thuận. Tuy nhiín, nhờ tổng biến thiín năng lượng tự do của 3 phản ứng trước đó có giâ trị đm khâ cao (-7,0Kcal/mol), cũng như nhờ sức kĩo nhiệt động học của câc phản ứng sau nó nín phản ứng xảy ra một câch dễ dăng.
5/ Phản ứng chuyển hóa tương hỗ giữa câc dạng triosophosphate: Dioxyacetonephosphate ––> Glyceraldehyde-3-phosphate ∆Go' = +1,83 Kcal/mol
Phản ứng do enzyme triosophosphate isomerase xúc tâc. Nó cần thiết cho glycolys vì trong hai loại triosophosphate xuất hiện khi phđn giải fructoso-1,6- diphosphate chỉ có D-glyceraldehyde-3-phosphate có thể chuyển hóa tiếp tục. Phản ứng năy kết thúc giai đoạn I của glycolys. ∆Go' của hai phản ứng sau cùng cộng lại có giâ trị khoảng +7,5Kcal/mol. Nếu cộng ∆Go' của cả 5 phản ứng của giai đoạn chuẩn bị trín đđy, ta có giâ trị +0,5Kcal/mol. Để glycolys có thể tiếp tục xảy ra, câc phản ứng kế tiếp phải lă những phản ứng giải phóng nhiều năng lượng tự do để tạo ra một sức kĩo nhiệt động học.
* Câc phản ứng của giai đoạn II.
6/ Phản ứng oxy-hóa glyceraldehyde-3-phosphate thănh acid 1,3- diphosphoglyceric.
Đđy lă một trong những giai đoạn quan trọng nhất của glycolys, vì năng lượng giải phóng khi oxy-hóa aldehyde 3-phosphoglyceric được giữ lại ở dạng sản phẩm cao năng 1,3-diphosphoglycerate. Việc phât hiện cơ chế năy do Warburg thực hiện trong những năm 1937-1938 được xem lă một trong những phât minh quan trọng nhất của sinh học hiện đại. Lần đầu tiín trong lịch sử sinh hóa đê phât hiện được cơ chế của câc phản ứng enzyme cho phĩp năng lượng giải phóng trong phản ứng oxy hóa câc phđn tử hữu cơ có thể được tích lũy lại trong câc phđn tử ATP. Toăn bộ quâ trình năy được xúc tâc bởi enzyme glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. Đđy lă một enzyme có cấu trúc phức tạp. Enzyme thu nhận được từ nấm men có trọng lượng phđn tử 140.000 vă được cấu tạo từ 4 phần dưới đơn vị giống nhau, mỗi phần dưới đơn vị lă một chuỗi polypeptide chứa khoảng 330 gốc aminoacid. Phương trình tổng quât của phản ứng có thể viết dưới dạng sau đđy:
2 -Glyceraldehyde-3-phosphate + 2NAD+ + 2Pi ––> ––> 2(1,3-diphosphoglycerate) + 2NAD.H + 2H+
∆Go' = 2 x 1,5Kcal/mol + 3,0 Kcal. Trong phản ứng năy chức aldehyde của glyceraldehyde-3-phosphate bị oxy-hóa thănh chức carboxyl. Tuy nhiín, thay cho acid 3-phosphoglyceric đê hình thănh acid 1,3-diphosphoglyceric, mă như ta đê biết, có giâ trị đm của ∆Go' cịn cao
hơn cả ATP. Phản ứng có giâ trị dương của ∆Go' khơng lớn lắm nín có thể xảy ra theo cả hai chiều, tùy thuộc văo nồng độ của câc chất ban đầu vă sản phẩm của phản ứng.
Trong khi phần lớn câc phản ứng oxy-hóa lă những phản ứng giải phóng năng lượng thì phản ứng năy lại có ∆Go' > 0. Để hiểu được sự diễn biến năng lượng của nó, cần phải tâch nó thănh hai q trình riíng biệt. Ký hiệu glyceraldehyde-3- phosphate lă R-CHO, còn acid 1,3-diphosphoglyceric lă R-COOPO32- , hai q trình riíng biệt năy có thể được viết ở dạng như sau:
1/ R-CHO + H2O + NAD+ ––> R-COO- + NAD.H + H+ ∆Go' = -10,3Kcal/mol;
2/ RCOO- + Pi –––––––––––> RCOOPO32- + H2O ∆Go' = +11,8Kcal/mol.
Như vậy, ∆Go's = ∆Go'1 + ∆Go'2 = -10,3 + 11,8 = +1,5Kcal/mol
Nếu tính cả số năng lượng tích lũy lại trong phđn tử NAD.H với giâ trị khoảng 50Kcal/mol (năng lượng năy chỉ có ý nghĩa trong điều kiện hiếu khí), ta sẽ thấy tầm quan trọng to lớn về phương diện năng lượng của phản ứng oxy hóa - khử năy.
Nếu xem xĩt sự biến thiín năng lượng đơn thuần qua câc giâ trị ∆Go' thì cho đến phản ứng năy tổng giâ trị
∆Go' bằng +3,5Kcal/ mol, tức chuyển về
phía bất lợi cho glycolys. Cơ chế của q trình oxy-hóa quan trọng năy đê được nghiín cứu khâ chi tiết. Kết qủa thu được cho phĩp xđy dựng sơ đồ mơ tả trong hình 12.
Mỗi một trong 4 phần dưới đơn vị giống hệt nhau của enzyme liín kết với một phđn tử NAD+ vă có một trung tđm hoạt động mă thănh phần rất quan trọng của nó lă nhóm -SH.
Trước tiín, enzyme kết hợp với NAD+ vă vì thế nhóm -SH bị phong toả. Sau đó chức aldehyde của cơ chất tương tâc với nhóm -SH, tạo ra một thiosemi- acetal. Giai đoạn tiếp theo lă vận chuyển nguyín tử hydro vốn liín kết đồng
hóa trị với glyceraldehyde-3-phosphate đến NAD+ liín kết, khử nó thănh NAD.H,
đồng thời hình thănh thioester giữa nhóm -SH của enzyme với nhóm carboxyl của cơ chất. Phđn tử NAD ở trạng thâi khử vẫn không tâch khỏi enzyme mă nhường
hydro (vă điện tử) của mình cho phđn tử NAD+ (có trong mơi trường) để được trở
lại trạng thâi oxy-hóa. Phức hệ giữa cơ chất vă enzyme ở giai đoạn năy được gọi lă acyl-enzyme. Gốc acyl sau đó được chuyển từ nhóm -SH của enzyme sang phđn tử phosphate vô cơ để tạo ra sản phẩm oxy-hóa 1,3-diphosphoglycerate, đồng thời giải phóng enzyme tự do ở dạng oxy-hóa để xúc tâc chu kỳ phản ứng tiếp theo.
Hình 12. Sơ đồ diễn biến của phản ứng oxy hóa glyceraldehyde-3-phosphate thăng acid 1,3-diphosphoglyceric.
7/ Phản ứng vận chuyển nhóm phosphate từ 1,3-diphosphoglycerate đến ADP:
1,3-Diphosphoglycerate hình thănh trong phản ứng trín tiếp tục phản ứng với ADP để tổng hợp ATP:
2(1,3-Diphosphoglycerate) + 2ADP⎯⎯> 2(3-Phosphoglycerate) + 2ATP ∆Go' = -4,5Kcal/mol x 2 = -9,0Kcal
Phản ứng được xúc tâc bởi enzyme phosphoglycerate kinase. Giâ trị đm khâ cao của phản ứng năy lă yếu tố thúc đẩy phản ứng xảy ra rước đó. Đến đđy hai phđn tử ATP được phục hồi, đồng thời tổng giâ trị ∆Go' đê chuyển về phía có lợi (- 5,5Kcal/mol).
Mg2+
2(3-phosphoglycerate) ⎯⎯> 2(2-phosphoglycerate) ∆Go' = +0,75Kcal/mol x 2 = +1,5Kcal
Xúc tâc phản ứng lă enzyme phosphoglyceromutase. Trong phản ứng gốc