5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SINH TRƯỞNG VÀ
TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID TRONG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ 3.3.1. Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men
3.3.1.1. Sinh trưởng tế bào
Từ các thí nghiệm nuôi cấy tế bào huyền phù, công thức tích lũy sinh khối và oleanolic acid tốt nhất là cơ bản MS chứa 1 mg/L BAP và 0,5 mg/L 2,4-D (Bảng 3.7). Do đó, nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor lên khả năng sản xuất oleanolic acid được thực hiện trên môi trường này.
Kết quả nghiên cứu trình bày ở bảng 3.9 cho thấy, YE đã ảnh hưởng lên sinh trưởng tế bào. Khi bổ sung YE vào thời điểm ban đầu (0 ngày), ở tất cả các nồng độ thử nghiệm sinh trưởng của tế bào đinh lăng lá nhỏ đều bị ức chế
so với đối chứng. Sinh khối tươi giảm nhiều (1,54-1,81 g/bình) so với đối chứng là 6,37 g/bình. Sinh khối khô cũng có sự thay đổi có ý nghĩa thống kê giữa các công thức xử lý elicitor (0,20-0,26 g) so với đối chứng 0,39 g (p<0,05). Nhìn chung, nồng độ YE càng cao thì sinh trưởng tế bào càng giảm.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của YE lên sinh trưởng của tế bào đinh lăng lá nhỏ.
Nồng độ Thời điểm Khối lượng tế bào
(g/bình) GI Trạng thái (g/L) (ngày) Tươi Khô ĐC 6,37a 0,39a 3,19a Vàng xanh, cứng, có hóa nâu (rất ít) 0 1,81e 0,26d 0,91c Nâu đậm, dai 1 3 2,34d 0,30c 1,17c Nâu, dai 6 5,05b 0,48a 2,52b Vàng xanh, cứng 9 6,12a 0,46a 3,06a Vàng xanh, cứng 0 1,72e
0,22d 0,86c Nâu đậm hơn, dai
2 3 2,16d 0,28cd 1,08c Nâu đậm, dai 6 3,88c 0,44b 1,94b Vàng, nâu, cứng 9 3,90c 0,47a 1,95c Vàng, nâu ít, cứng 0 1,54e
0,20d 0,77c Nâu đen, dai
3 3 1,73e
0,27cd 0,87c Nâu đen, dai
6 3,31c
0,39bc 1,66bc Nâu, vàng, cứng
9 3,54b
0,46a 1,77bc Nâu, vàng, cứng
Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có mức ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p<0,05 (Duncan’s test). ĐC: đối chứng không bổ sung elicitor
Chỉ số sinh trưởng của tế bào (GI) cũng thay đổi tương tự như sinh khối tế bào, bổ sung nồng độ YE càng cao thì sinh trưởng tế bào càng giảm và
khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Trong đó, ở 3 g/L YE, sinh trưởng tế bào giảm khoảng 4 lần so với đối chứng (0,77 so với 3,19).
Tại các thời điểm bổ sung sau 3, 6 và 9 ngày nuôi cấy, sinh trưởng tế bào cao hơn so với thời điểm bổ sung lúc bắt đầu nuôi cấy. Số ngày tế bào được xử lý YE tỷ lệ nghịch với sự sinh trưởng, điều này có nghĩa là số ngày tế bào được cảm ứng càng ít thì sinh trưởng tế bào càng ít bị ức chế. Như vậy, tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ sinh trưởng tốt nhất khi bổ sung YE với nồng độ 1, 2, 3 g/L lần lượt sau 9 ngày nuôi cấy. Về trạng thái vật lý, tế bào sẽ có màu nâu đậm và mềm hơn khi thời gian tác dụng với YE càng dài. Thời điểm xử lý elicitor là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng tích lũy các sản phẩm thứ cấp của tế bào thực vật.
Do sinh trưởng của tế bào ít bị ức chế khi thời gian xử lý elicitor ngắn, nên GI ở các công thức thí nghiệm tăng dần từ thời điểm bổ sung YE ban đầu cho đến thời điểm bổ sung vào ngày thứ 9, và nồng độ YE bổ sung càng thấp thì GI càng cao. GI có giá trị thấp nhất khi bổ sung 3 g/L YE vào thời điểm ban đầu nuôi cấy (0,77) và cao nhất khi bổ sung 1 g/L YE vào ngày nuôi cấy thứ 9 (3,06), thấp hơn so với đối chứng (3,19). Các hình 3.9 và 3.10 minh họa sinh khối tế bào khi được xử lý YE ở các nồng độ và thời điểm khác nhau.
3.3.1.2. Hàm lượng oleanolic acid
Khi bổ sung YE ở các nồng độ khác nhau vào môi trường nuôi cấy hàm lượng oleanolic acid đã tăng lên đáng kể so với đối chứng, trong đó thời điểm 6 ngày cho hàm lượng cao nhất ở tất cả các nồng độ của YE.
Ở môi trường bổ sung 1 g/L YE khối lượng khô của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ đạt cao nhất (0,48 g/bình) (Bảng 3.9), sinh tổng hợp oleanolic acid đã tăng lên 6,47 lần so với đối chứng không bổ sung elicitor (78,55 mg/bình). Bổ sung 2 g/L YE vào ngày thứ 6, hàm lượng oleanolic acid tăng lên đáng kể, gấp 3,89 lần đối chứng (43,18 mg/bình). Khi tăng nồng độ
YE, hàm lượng oleanolic acid cũng tăng lên nhưng không cao bằng các công thức bổ sung YE nồng độ thấp. Ở công thức bổ sung 3 g/L YE, hàm lượng oleanolic acid cũng cao gấp 2,55 lần đối chứng (Bảng 3.10).
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của YE lên tích lũy oleanolic acid của tế bào đinh lăng lá nhỏ.
Thời điểm bổ Hàm lượng Hàm lượng Tăng so với
YE oleanolic acid oleanolic acid đối chứng
sung (ngày (g/L) (mg/g khô) (mg/bình) (lần) nuôi cấy) ĐC 25,40d 9,86d 1,00 0 37,34d 9,60d 1,47 3 95,00b 28,31b 3,74 1 6 164,34a 78,55a 6,47 9 84,84b 39,36b 3,34 0 34,29d 7,48d 1,35 3 66,55c 18,43c 2,62 2 6 98,81b 43,18b 3,89 9 61,21c 28,65c 2,41 0 27,69d 5,51d 1,09 3 42,42d 11,28d 1,67 3 6 64,77c 25,26c 2,55 9 42,93d 19,79d 1,69
ĐC: đối chứng không bổ sung elicitor
Thời điểm xử lý elicitor khác nhau, hiệu quả thu được cũng khác nhau, trong đó tốt nhất là bổ sung sau 6 ngày nuôi cấy, việc bổ sung YE vào thời điểm 3 ngày hay 9 ngày cho hiệu quả tương đương ở tất cả các nồng độ được khảo sát, và cao hơn thời điểm bổ sung ban đầu. Trong quá trình sinh trưởng của tế bào đinh lăng lá nhỏ, 6 ngày là thời điểm tế bào đạt 1/3 thời gian sinh
trưởng (Hình 3.6), tế bào kết thúc pha lag và bắt đầu vào pha sinh trưởng (pha log), nên thuận lợi cho việc bắt đầu tích lũy hợp chất thứ cấp trong tế bào.
A B C
Hình 3.9. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô (C) của tế bào đinh lăng lá nhỏ trong môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1 mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung YE 3 g/L lúc bắt đầu nuôi cấy.
A B C
Hình 3.10. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô (C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1 mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung YE 1 g/L sau 6 ngày nuôi cấy.
3.3.2. Ảnh hưởng của methyl jasmonate
3.3.2.1. Sinh trưởng tế bào
Bổ sung MeJA với các nồng độ 10, 50 và 100 µM vào môi trường vào thời điểm ban đầu và sau 3 đến 9 ngày nuôi cấy cho thấy tế bào huyền phù
đinh lăng lá nhỏ có sự sinh trưởng khác nhau (Bảng 3.11, Hình 3.11 và 3.12).
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của MeJA lên sinh trưởng của tế bào đinh lăng lánhỏ.
Thời Khối lượng tế bào
MeJA (g/bình) GI Trạng thái
điểm
(µM)
(ngày) Tươi Khô
0 4,39c 0,36b 2,20c Vàng xanh, cứng 3 4,56c 0,36b 2,28c Vàng xanh, cứng 10 6 4,99b 0,39a 2,49b Vàng, cứng 9 6,18a 0,41a 3,09a Vàng xanh, cứng 0 3,70c 0,34b 1,85cd Vàng, cứng 3 4,67bc 0,35b 2,34bc Vàng xanh, cứng 50 6 5,10b 0,40a 2,55b Vàng, cứng 9 5,65ab 0,40a 2,83ab Vàng xanh, cứng 0 2,16d 0,28c 1,08d Vàng nâu, cứng 3 4,09c 0,35b 2,05c Vàng, cứng 100 6 4,81bc 0,39a 2,40bc Vàng, cứng 9 5,14b 0,39a 2,57b Vàng xanh, cứng
Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có mức ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p<0,05 (Duncan’s test).
Khi được bổ sung vào thời điểm ban đầu, tất cả nồng độ khác nhau của MeJA đều ức chế sinh trưởng tế bào đinh lăng lá nhỏ. Sinh khối tươi của chúng giảm nhiều (chỉ đạt 2,16-4,39 g/bình) so với đối chứng là 6,37 g/bình (Bảng 3.9). Tuy nhiên, sinh khối khô thay đổi không đáng kể (0,28-0,36 g/bình) so với đối chứng 0,39 g/bình (Bảng 3.9 và 3.11). Nhìn chung, nồng độ MeJA bổ sung vào môi trường càng cao thì sinh trưởng tế bào càng giảm. Về trạng thái tế bào, khi xử lý nồng độ MeJA càng cao, tế bào càng có xu hướng
hóa nâu và cứng hơn, chỉ số sinh trưởng thấp hơn ở các nồng độ MeJA thấp. Số liệu ở bảng 3.11 cũng cho thấy, thời điểm bổ sung MeJA đã ảnh
hưởng đến khả năng sinh trưởng của tế bào đinh lăng lá nhỏ. Tại các thời điểm 3, 6 và 9 ngày, sinh trưởng tế bào đều cao hơn so với thời điểm bổ sung lúc bắt đầu nuôi cấy. Ở tất cả các nồng độ xử lý, bổ sung vào thời điểm 9 ngày sau khi nuôi cấy gây ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào ít nhất, tất cả các chỉ số sinh trưởng, khối lượng tươi, khối lượng khô đều đạt cao nhất, gần bằng đối chứng không xử lý elicitor. Trong từng thời điểm xử lý elicitor, nồng độ MeJA càng cao ức chế sinh trưởng tế bào càng lớn, tuy nhiên, sự khác nhau khi xử lý ở thời điểm 6 ngày và 9 ngày không có ý nghĩa thống kê ở các nồng độ xử lý cao (50-100 µM).
Như vậy, tương tự YE, thời gian tế bào được cảm ứng với MeJA càng ngắn thì sinh trưởng của tế bào càng cao và ngược lại, tế bào sinh trưởng kém khi thời gian tế bào được cảm ứng dài (bổ sung elicitor lúc bắt đầu nuôi cấy).
3.3.2.2. Hàm lượng oleanolic acid
Để khảo sát ảnh hưởng của MeJA lên khả năng tích lũy oleanolic acid của tế bào đinh lăng lá nhỏ, MeJA đã được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với các nồng độ và thời điểm khác nhau, sau đó thu kết quả vào ngày thứ 16 (Bảng 3.12).
Kết quả khảo sát cho thấy, khi bổ sung MeJA vào môi trường nuôi cấy, hầu hết các công thức thí nghiệm đều có hàm lượng oleanolic acid cao hơn so với đối chứng không xử lý elicitor. Ở nồng độ 10 µM, thời điểm bổ sung MeJA tốt nhất là sau 6 ngày nuôi cấy, hàm lượng oleanolic acid thu được cao gấp 3,8 lần đối chứng (38,03 mg/bình) (Bảng 3.12).
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của MeJA lên tích lũy oleanolic acid của tế bào đinh lăng lá nhỏ.
Thời điểm bổ Hàm lượng Hàm lượng Tăng so
oleanolic acid oleanolic acid với đối
MeJA
sung (ngày nuôi (mg/g khô) (mg/bình) chứng
(µM) cấy) (lần) ĐC 25,40e 9,86e 1,00 0 45,21d 16,37d 1,78 3 60,96c 22,13c 2,40 10 96,52b 38,03b 6 3,80 9 71,88bc 29,62b 2,83 0 89,15b 30,22b 3,51 3 97,79b 34,42b 3,85 50 6 87,88b 35,24b 3,46 9 15,75e 6,31d 0,62 0 49,02d 13,58de 1,93 3 131,83a 45,48a 5,19 100 68,83c 26,50bc 6 2,71 9 64,01c 24,84c 2,52
ĐC: đối chứng không bổ sung elicitor
Ở môi trường có 50 µM, hàm lượng oleanolic acid tích lũy cao hơn đối chứng khoảng hơn 3,5 lần khi được bổ sung trong khoảng thời gian 0-6 ngày nuôi cấy, trong khi bổ sung vào thời điểm 9 ngày lại cho kết quả thấp hơn đối chứng, chứng tỏ thời gian không còn đủ cho quá trình sinh tổng hợp oleanolic acid. Công thức cho kết quả tích lũy oleanolic acid trong tế bào cao nhất là bổ sung 100 µM MeJA vào thời điểm 3 ngày sau khi nuôi cấy, oleanolic acid được tích lũy cao hơn đối chứng khoảng 5 lần (45,48 mg/bình) (Bảng 3.12).
A B C
Hình 3.11. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô (C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1 mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung MeJA 10 µM lúc bắt đầu nuôi cấy.
A B C
Hình 3.12. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô (C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung MeJA 100 µM sau 3 ngày nuôi cấy.
Như vậy, nồng độ cũng như thời điểm bổ sung MeJA và YE vào môi trường nuôi cấy đều có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tích lũy oleanolic acid của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ. Việc bổ sung elicitor vào quá trình nuôi cấy tế bào đinh lăng lá nhỏ đã giúp cải thiện khả năng tích lũy oleanolic acid trong tế bào. Trong đó, YE có hiệu quả cao hơn so với MeJA (YE tăng 6,47 lần trong khi MeJA tăng 5,19 lần). Do đó, bằng phương pháp này có thể sản xuất một lượng lớn oleanolic acid trong thời gian ngắn thay vì phải thu từ cây tự nhiên lâu năm.
Chương 4 BÀN LUẬN
4.1. ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN SINHTRƯỞNG CỦA CALLUS TRƯỞNG CỦA CALLUS
4.1.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng
Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự sinh trưởng của callus đinh lăng lá nhỏ đã được nhiều tác giả nghiên cứu và công bố. Chẳng hạn, Đỗ Tiến Vinh và cs (2015) đã nghiên cứu tạo callus từ lá đinh lăng lá nhỏ trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 2 mg/L 2,4-D, 1 mg/L KIN, 30 g/L sucrose cho tỷ lệ tạo callus 94,63%. Môi trường cơ bản MS có bổ sung 1 mg/L 2,4-D, 0,5 mg/L KIN, 30 g/L sucrose và 10% nước dừa thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh khối callus với tốc độ tăng sinh là 19,83 lần [21]. Theo Trịnh Việt Nga và cs (2017), sử dụng môi trường có bổ sung 2 mg/L 2,4-D cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo cao nhất ở cả cuống lá và phiến lá, tỷ lệ trung bình đạt 98,3% và khác biệt so với các nồng độ 2,4-D còn lại [15]. Theo Trương Thị Bích Phượng và cs (2017), môi trường cơ bản MS chứa 30 g/L sucrose và 1,5 mg/L 2,4-D là thích hợp nhất cho việc nhân sinh khối callus đinh lăng lá nhỏ sau 12 tuần nuôi cấy [17]. Tô Thị Nhã Trầm và cs (2020) nhận thấy mẫu lá đinh lăng lá nhỏ được sử dụng để làm vật liệu ban đầu trong nuôi cấy tạo mô sẹo có khả năng phát sinh phôi soma và tạo cây hoàn chỉnh [19],… Các nghiên cứu trên có đặc điểm chung là nghiên cứu phát sinh callus từ lá (phiến lá, cuống lá) với mục đích chính là nhân giống cây này thông qua quá trình phát sinh phôi soma từ callus.
Khác với các nghiên cứu trên, mục đích của đề tài này là tìm được dòng tế bào sinh trưởng nhanh, chất lượng tốt và đảm bảo các yêu cầu để làm nguyên liệu nuôi cấy tế bào huyền phù. Trong 3 loại callus đã được đánh giá,
callus có nguồn gốc từ thân phù hợp hơn callus có nguồn gốc từ lá và rễ. Callus có nguồn gốc từ thân có màu vàng, dạng hạt rời rạc, phù hợp để nuôi cấy tế bào huyền phù nên được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Môi trường cơ bản MS có bổ sung 1 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L KIN tốt nhất cho sự sinh trưởng của callus thân, khối lượng tươi và khối lượng khô trung bình của callus đạt cao nhất (lần lượt là 123,9 mg và 8,8 mg).
So với các công bố khác, nhìn chung khả năng sinh trưởng của callus thân không tốt bằng callus lá. Theo Trịnh Việt Nga và cs (2017), mẫu phiến lá nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D ở các nồng độ 1, 2 và 3 mg/L có đường kính mô sẹo lần lượt đạt 1,6 cm, 1,9 cm và 1,5 cm và có sự khác biệt so với mô sẹo hình thành từ cuống lá. Khối lượng mẫu tươi trung bình lớn hơn ở mẫu phiến lá (127,3 mg) và có sự khác biệt so với mô sẹo hình thành từ mẫu cuống lá. Mẫu phiến lá trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D nồng độ 2 mg/L cho khối lượng mô sẹo lớn nhất (219,7 mg) [15]. Sự khác biệt này có thể do nguồn mẫu vật sử dụng ban đầu khác nhau, môi trường nuôi cấy khác nhau để phục vụ cho các mục đích nghiên cứu khác nhau. Callus có nguồn gốc từ lá phù hợp cho việc nhân giống trong khi callus có nguồn gốc từ thân phù hợp cho nuôi cấy tế bào huyền phù.
4.1.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
TRYP là các đoạn peptide hình thành trong quá trình thủy phân casein bằng protease, TRYP thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cung cấp các amino acid. Trong nuôi cấy tế bào thực vật, TRYP được bổ sung vào môi trường để tăng cường khả năng sinh trưởng, kích thích nảy mầm, chẳng hạn như ở cây Paphiopedilum ciliolare [92].
Kết quả nghiên cứu trong luận án này cho thấy, hầu hết các môi trường bổ sung TRYP đều có xu hướng làm tăng kích thước của callus hơn so với môi trường không có bổ sung TRYP. Sinh trưởng của callus tốt nhất trên môi