FTS là tên gọi chung cho các enzim có hoạt tính xúc tác quá trình chuyển dịch gốc fructoza. Quá trình trên có thể xảy ra theo hai cách là cắt không gắn và cắt rồi gắn. Khả năng xúc tác cắt không gắn của enzim là hoạt tính thuỷ phân (viết tắt là UH) , còn khả năng cắt rồi gắn là hoạt tính chuyển hoá (viết tắt là UT). Phụ thuộc vào vị trí gắn các gốc fructoza lên chất nhận, enzim này đ−ợc phân ra nhiều loại với các tên gọi khác nhau nh−: 6G-fructosyltransferaza (6G-FT), 6F- fructosyltransferaza (6F-FT) và 1F-fructosyltransferaza (1F-FT). Các enzim trên xúc tác lên phân tử sacaroza tạo ra các loại FOS có phân tử l−ợng nh− nhau nh−ng không giống nhau về cấu trúc phân tử [48]. Ba enzim 6G-FT , 6F-FT và 1F-FT xúc tác gắn vào phân tử đ−ờng ở các vị trí khác nhau tạo ra các đ−ờng t−ơng ứng đ−ợc trình bày trên hình 1.5.
Các FTS có nguồn gốc từ thực vật chỉ có hoạt tính UT, nh−ng mang tính đặc hiệu cơ chất t−ơng đối (gắn gốc fructoza vào phân tử đ−ờng sacroza khác ở nhiều vị trí khác nhau), trong khi đó FTS có nguồn gốc từ vi sinh vật lại có cả hai loại hoạt tính UT và UH nh−ng hoạt tính gắn lại có tính đặc hiệu cơ chất gần nh− tuyệt đối [5], [6], [24], [56]. Enzim FTS có nguồn gốc khác nhau cũng khác nhau về cấu tạo hoá học. FTS tổng hợp từ vi sinh vật là những enzim đa cấu tử, có phân tử l−ợng cao (> 10.000 Da), trong phân tử có chứa các nhóm glucozit. Nhiệt độ hoạt động thích hợp của enzim này là 50 0C – 55 0C, pH thích hợp là 5. Khác với enzim tổng hợp từ vi sinh vật, FTS trong thực vật có phân tử l−ợng nhỏ hơn và trong phân tử không chứa nhóm glucozit. Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của chúng là 30 0C – 450C. Cần nói thêm FTS là loại enzim đặc hiệu, nó chỉ có thể tác dụng xúc tác
phân cắt và gắn kết gốc fructoza trong phân tử sacaroza hoặc các dẫn xuất của sacaroza để tạo thành FOS. Còn ở trong dung dịch chỉ có fructoza và glucoza thì enzim này không có khả năng xúc tác tạo FOS.
Vì FOS có sẵn trong tự nhiên, tồn tại trong các loại cây củ nên nguồn enzim tổng hợp FOS đầu tiên phải là từ các loại thực vật trên. Alen và Bacon [5] đã phát hiện trên lá cây củ cải đ−ờng có chứa enzim xúc tác sacaroza tạo ra hai trioza thuộc nhóm fructooligosacarit là 1-kestoza và 6-kestoza. Trong cây atiso chứa enzim tổng hợp đ−ờng tetrasacarit (GF3) và các enzim tổng hợp đ−ờng fructooligosacarit có phân tử l−ợng lớn hơn (GFn) [16][17]. Trong củ hành tây và măng tre còn chứa phức hệ ba enzim [48], [49], [50], [11] có tên gọi là:
+ 1F-sacaraza: sacaraza (SST) + 6G-fructosyltransferaza (6G-FT) + 1F-fructosyltransferaza (1F-FT)
Ngoài thực vật ra, vi sinh vật cũng là nguồn tạo enzim chuyển hoá fructoza lớn nh− đã giới thiệu ở mục trên.
1.5 Giới thiệu về enzim glucooxydaza (GOD) 1.5.1 Đặc tính của enzim GOD
Các nghiên cứu về cấu tạo và đặc tính của enzim GOD đã đ−ợc A. Crueger và W.Crueger thực hiện năm 1990 [13]. Các tác giả đã kết luận enzim GOD là hợp chất glucoprotein, có phân tử l−ợng khoảng 155 X 103 DA. GOD chứa 2 phân tử FAD và 16% khối l−ợng phân tử là hydratcacbon ( mannoza, galactoza và glucosamine d−ới dạng N-acetyl). Mạch hydratcacbon trong phân tử GOD không tham gia xúc tác và cấu tạo của nó cho tới nay cũng ch−a đ−ợc nghiên cứu rõ ràng. Enzim GOD sinh tổng hợp từ A. niger có cấu tạo bởi 583 axit amin [32]. Điểm đẳng điện của enzim này là pH 4.2 [58], [64]. Enzim GOD có tính đặc hiệu rất cao, chỉ cần một thay đổi nhỏ trong cấu trúc thì hoạt lực oxy hóa của enzim đã khác hẳn nhau, ví dụ gốc glucoza trong phân tử enzim ở dạng β - D glucoza có hoạt tính oxy hóa mạnh hơn α - D glucoza 157 lần [52]. Enzim GOD còn có một đặc tính quan trọng là rất an toàn về mặt thực phẩm [25].
1.5.2 Cơ chế xúc tác của enzim GOD
Phản ứng oxy hoá của glucoza d−ới xúc tác của enzim GOD đ−ợc thực hiện theo các ph−ơng trình biểu diễn ở hình 1.5.
Theo ph−ơng trình phản ứng ta thấy, đầu tiên glucoza d−ới tác dụng của enzim GOD bị oxy hoá tạo thành β-D-glucolacton, sau đó tự phân thành axit gluconic. Sự tạo thành axit gluconic sẽ làm giảm pH của môi tr−ờng, nên trong quá trình phản ứng phải đồng thời bổ sung kiềm để điều chỉnh pH (ph−ơng pháp potentionmetric).
Theo cơ chế hoạt động của enzim GOD thì quá trình oxy hoá glucoza luôn có sự hình thành H2O2., chính sản phẩm phụ này lại ức chế hoạt động của enzim GOD. CH2OH O OH OH FAD FADH2 HO H2O2 O2 OH β -D Glucoza O C H C O O HO C H H C OH H C CH2OH β-D-glucolacton COOH H C H HO C H H C OH H C OH CH2OH Axit gluconic
Hình 1.5: Quá trình oxy hoá glucoza d−ới tác dụng của enzim GOD
Về ảnh h−ởng của H2O2 trong phản ứng oxy hoá glucoza đã đ−ợc nhiều tác giả nghiên cứu nh− Kleppe [35], Bourdillon [8], Tse và Googh [62]. Các kết quả đều cho thấy hoạt lực của GOD giảm tỷ lệ với sự tăng của nồng độ H2O2. Và vì thế trong sản xuất FOS nếu chỉ dùng một enzim GOD thì ta chỉ có thể chuyển hóa đ−ợc một phần nhất định l−ợng glucoza sinh ra và độ tinh khiết của FOS cũng sẽ bị hạn chế ở mức thấp. Kết quả nghiên cứu của Lamia [36] cho thấy mặc dù đã dùng nhiều ph−ơng phấp để cải thiện điều kiện phản ứng oxy hóa glucoza có enzim
GOD xúc tác nh−ng hàm l−ợng FOS trong sản phẩm không thể v−ợt quá 61.26 % và l−ợng glucoza bị chuyển hóa chỉ hạn chế trong khoảng 16%. Hoạt lực của enzim GOD luôn biểu hiện giảm mạnh sau 5 giờ phản ứng.
CH2OH O OH OH FAD FADH2 HO H2O2 O2 OH β -D Glucoza O C H C O O HO C H H C OH H C CH2OH β-D-glucolacton COOH H C H HO C H H C OH H C OH CH2OH Axit gluconic H2O2 –––––––––> 2H2O + O2 catalaza GOD + CAT 2C6H12O6 + O2 ––––––––––––> 2C6H12O7 Gluconic axit
Hình 1.6 : Phản ứng ôxy hoá glucoza d−ới tác dụng của hệ hai enzim GOD-CAT
Để giải quyết tồn tại trên, cần thiết phải loại bỏ nhân tố ức chế enzim GOD là H2O2. Điều này có thể tiến hành bằng cách bổ sung thêm một loại enzim khác có khả năng chuyển hóa H2O2 đó là catalaza (CAT). Quá trình oxy hóa glucoza d−ới tác dụng của hệ enzim GOD- CAT đ−ợc thể hiện theo ph−ơng trình phản ứng ở hình 1.6
1.6 Tiềm năng cho sản xuất FOS tại Việt Nam
Việt Nam là một n−ớc có ngành công nghiệp mía đ−ờng phát triển từ rất sớm. Thực hiện chủ tr−ơng và chính sách của chính phủ, đến năm 2000 đã có 47
nhà máy trrên toàn quốc đi vào hoạt động và sản l−ợng đ−ờng đạt tới một triệu tấn. Cây mía có thể trồng ở tất cả các địa danh toàn quốc. Các vùng tập trung trồng mía nhiều là các tỉnh thuộc Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ, Đông Nam Bộ và Đồng Bằng Sông Cửu Long. Sản l−ợng mía và đ−ờng mía hàng năm không ngừng đ−ợc nâng cao. Quá trình tăng tr−ởng của ngành công nghiệp mía đ−ờng từ năm 1998 đến năm 2001 đ−ợc trình bày trên bảng 1.2 [3]
Số liệu thống kê trên bảng 1.2 cho thấy Việt Nam có sản l−ợng đ−ờng mía t−ơng đối cao, đó là nguồn nguyên liệu dồi dào cho ngành sản xuất FOS, một mặt hàng ch−a đ−ợc phát triển trong thị tr−ờng nội địa.
Bảng 1.2 : Diễn biến tăng tr−ởng của ngành công nghiệp mía đ−ờng trên toàn quốc
Năm 1998 1999 2000 2001 Sản l−ợng mía (nghìn tấn) 13843,5 17760,3 15044,3 14325,4 Sản l−ợng đ−ờng (nghìn tấn) 736,0 947,3 1208,7 1957,8 Diện tích trồng mía (nghìn hecta) 283,0 344,2 302,3 291,0
Cùng với nguồn nguyên liệu dồi dào, Việt Nam còn có nguồn nhân lực lớn, có trình độ khoa học để làm chủ công nghệ sinh học nói chung và chế biến thực phẩm nói riêng. Vì vậy việc mở ra một ngành sản xuất mới sử dụng công nghệ hiện đại để tạo nên sản phẩm FOS với nhiều đặc tính −u việt, có giá trị cao hơn đ−ờng kính về đặc tính chức năng, cung cấp cho thị tr−ờng trong n−ớc và xuất khẩu, làm nguyên liệu cho các sản phẩm chức năng nh− bánh kẹo, thực phẩm cho ng−ời mắc bệnh tiểu đ−ờng, sữa và bột ding d−ỡng cho trẻ em v.v… là cần thiết và hoàn toàn khả thi.
Ch−ơng 2
Nguyên liệu, thiết bị và ph−ơng
pháp nghiên cứu
2.1 Nguyên vật liệu và hoá chất 2.1.1 Giống vi sinh vật
- Phân lập từ các mẫu đất ở các nhà máy đ−ờng phía Bắc Việt Nam. - Bộ s−u tập giống vi sinh vật của Viện Công nghiệp thực phẩm.
2.1.2 Enzim
- Fructosyltransferaza (FTS) từ tr−ờng đại học Giang Nam Trung Quốc
- Glucooxydaza (GOD) (EC 1.1.3.4) từ Aspergillus niger: Công ty hoá chất Sigma, Mỹ.
- Catalaza (CAT) (EC1.11.1.6) từ gan bò : Công ty hoá chất Sigma, Mỹ. - Amylaza: Hãng Novo Đan Mạch
2.1.3 Nguyên vật liệu chính
- Đ−ờng kính: đ−ờng kính Lam Sơn loại I, mua tại các siêu thị và cửa hàng thực phẩm Việt Nam;
- Aga, cao nấm men: Trung Quốc. - Đất trợ lọc : Sigma, Mỹ.
- Than hoạt tính: Sigma, Mỹ.
- Bản mỏng sắc ký TLC silica gel 60 F 254: Merck, Đức. - Hạt trao đổi ion: Trung Quốc.
- Các loại nguyên liệu khác: Mua tại thị tr−ờng Việt Nam
2.1.4 Hoá chất
- Glucoza, fructoza tiêu chuẩn : Trung Quốc. - Nystoza, kestoza tiêu chuẩn : Fluka, Nhật Bản.
- N-propynol, ethylacetat, diphenylamin, anilin, axit photphoric, dinitrihipophotphat, axit citric, pepton, magesulphat, kalihipophotphat của Công ty hoá chất Y d−ợc, Th−ợng Hải, Trung Quốc.
- Các loại hoá chất khác có độ tinh khiết cho phân tích sắc ký và phân tích, đ−ợc mua tại thị tr−ờng hoá chất Trung Quốc và Việt Nam.
2.2 Các thiết bị chủ yếu
- Thiết bị nuôi cấy và lên men. + Tủ sấy: Sanyo , Nhật Bản. + Tủ cấy vô trùng: Việt Nam. + Tủ ấm: Trung Quốc
+ Máy lắc ổn tốc, ổn nhiệt: Việt Nam + Tủ lạnh: Sanyo, Nhật.
- Thiết bị phản ứng
+ Nồi cách thuỷ ổn nhiệt: Lauda, Đức.
+ Thiết bị khuấy từ gia nhiệt: HB4 basic Malaysia. + Thiết bị cô chân không: B⎫chi Potavapor R-114. + Thiết bị đo pH ORION, model 410A.
- Thiết bị phân ly
+ Cột sắc ký trao đổi ion : φ 4,5cm x 50cm Th−ợng Hải, Trung Quốc. - Thiết bị phân tích
+ Hệ thống thiết bị sắc ký lỏng cao áp HPLC: Nhật Bản + Máy so màu Genesis, Mỹ.
+ Chiết quang kế: Trung Quốc. - Thiết bị công nghệ
+ Dây chuyền sản xuất bột dinh d−ỡng trẻ em: Viện Công nghiệp thực phẩm
+ Dây chuyền sản xuất bánh hích quy và kẹo: Công ty thực phẩm Hà Tây + Dây chuyền sản xuất bánh hích quyvà kẹo: Cơ sở sản xuất bánh kẹo Phúc Long
2.3 Ph−ơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Ph−ơng pháp vi sinh vật 2.3.1 Ph−ơng pháp vi sinh vật 2.3.1 Ph−ơng pháp vi sinh vật 2.3.1.1 Phân lập, tuyển chọn giống
- Phân lập theo ph−ơng pháp pha loãng, nuôi cấy trên môi tr−ờng khoai tây.
- Phân lập theo hoạt lực của enzim [8].
2.3.1.2 Môi tr−ờng nuôi cấy vi sinh vật
- Môi tr−ờng n−ớc chiết khoai tây [8] : 200 g/l khoai tây, 20g/l đ−ờng kính, 20 g/l aga, pH 6,0. Thanh trùng ở áp lực1kg/cm2 trong 20 phút.
- Môi tr−ờng nhân giống: đ−ờng kính 150 g/l, cao nấm men 5 g/l, pepton 10 g/l; MgSO4.7H2O 1 g/l, KH2PO4 0,5 g/l, pH 6,5. Thanh trùng ở áp lực 1 kg/cm2 trong 20 phút.
- Môi tr−ờng lên men: 150 g/l đ−ờng kính, 5 g/l cao nấm men, 10 g/lpepton, 1 g/l MgSO4.7H2O, 0,5 g/l KH2PO4, pH 6,5. Thanh trùng ở áp lực 1 kg/cm2
trong 20 phút.
- Môi tr−ờng n−ớc chiết malt: 10 – 11 0Bx n−ớc chiết malt, 2-2,5% agar, 0,3 % pepton, pH 5,6. Thanh trùng ở áp lực 1 kg/cm2 trong 20 phút.
- Môi tr−ờng Czapek: 30 g/l đ−ờng kính, 0,2 % tinh bột, 0,001% FeSO4, 0,05 % MgSO4, 0,05 % KCl, 0,1 % KH2PO4, 0,3 % NaNO3, 2,5 % agar. Thanh trùng ở áp lực 1 kg/cm2 trong 20 phút.
2.3.1.3 Nuôi cấy vi sinh vật [2], [1]
- Nuôi cấy trên hộp lồng: nhiệt độ 30 0C trong 48 giờ .
- Nuôi cấy trên ống thạch nghiêng: nhiệt độ 30 0C trong 3 ngày.
- Nuôi cấy giống cấp 1: nuôi trong bình tam giác 500 ml có chứa 50 ml dịch, lên men trên máy lắc với tần số 200 vòng/ phút, biên độ 10 mm, nhiệt độ 30
0
C trong thời gian 24 giờ.
2.3.1.4 Ph−ơng pháp phân loại và định tên vi sinh vật
Quá trình phân loại của chủng nấm mốc VVTP 84 đ−ợc tiến hành bằng cách nuôi cấy vi sinh vật trên ba môi tr−ờng đặc tr−ng đó là môi tr−ờng n−ớc chiết khoai tây, môi tr−ờng Czapek và môi tr−ờng n−ớc chiết malt. Vi sinh vật đ−ợc
quan sát theo dõi trong suốt thời gian nuôi cấy bằng mắt th−ờng, kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử. Cuối cùng vi sinh vật đ−ợc xác định tên dựa trên các khoá phân loại thích ứng.
2.3.1.5 Lên men tổng hợp enzim
Lên men chìm trong bình tam giác: bình tam giác 250 ml có chứa 30 ml dịch hoặc bình tam giác 500 ml chứa 50 ml dịch trong đ−ợc lên men trên máy lắc với tần số 200 vòng/phút, biên độ 10 mm, nhiệt độ 30 0C trong thời gian 36 giờ.
2.3.2 Các ph−ơng pháp hoá sinh, hoá lý 2.3.2.1 Chiết tách enzim [8] 2.3.2.1 Chiết tách enzim [8] 2.3.2.1 Chiết tách enzim [8]
- Xử lý sinh khối: Sinh khối thu đ−ợc sau lên men đ−ợc rửa sạch bằng n−ớc cất và dung dịch đệm Mcllvaine (muối photphat natri - axit citric) 0,1 M pH5.
- Phá vỡ tế bào : Sử dụng 3 ph−ơng pháp là nghiền bi, đồng hoá siêu tốc và siêu âm. Cả 3 ph−ơng pháp trên đều dùng dung dịch đệm Mcllvaine (muối phốt phát natri- axit citric) 0,1M pH= 5.
- Chiết tách enzim: Sau khi phá vỡ tế bào, hỗn dịch đ−ợc ngâm 3 giờ ở nhiệt độ 40C. Cuối cùng enzim thô đ−ợc tách ra từ hỗn dịch bằng cách lọc chân không, hoặc li tâm lạnh. Enzim thô sau đó đ−ợc đem phân tích hoạt lực. Quá trình tuyển chọn giống sẽ căn cứ vào hoạt lực của enzim.
2.3.2.2 Xác định hoạt lực enzim
Hoạt lực của enzim đ−ợc xác định theo ph−ơng pháp của Hidaka cải tiến [29]. Ph−ơng pháp này đ−ợc tiến hành nh− sau: dịch phản ứng chứa 25% đ−ờng sacaroza (10ml), dung dịch đệm pH 5 (5ml), enzim thô 0,5ml. Phản ứng xảy ra trong thời gian 1giờ ở nhiệt độ 50oC. Kết thúc phản ứng enzim đ−ợc bất hoạt trong n−ớc sôi 10 phút. Hoạt tính UH và UT đ−ợc xác định thông qua l−ợng đ−ờng kestoza và fructoza t−ơng ứng đ−ợc tạo thành sau phản ứng. Một đơn vị hoạt lực đ−ợc định nghĩa là l−ợng enzim cần thiết cho sự tạo thành 1 àmol đ−ờng t−ơng ứng trong thời gian 1 phút d−ới điều kiện phản ứng nh− trên.
Trong quá trình sơ tuyển giống thì hoạt lực enzim đ−ợc sơ bộ xác định thông qua sắc ký bản mỏng.
2.3.2.3 Xác định thành phần đ−ờng (định tính) bằng sắc ký bản mỏng
Sắc ký bản mỏng đ−ợc làm theo ph−ơng pháp của Jiang Bo. Cách làm đ−ợc tiến hành nh− sau:
- Dung dịch chạy: n-propynol : ethylacetate : n−ớc cất ( 7/1/2).
- Chất hiện màu: Dung dịch difenylamin, benzoamin, axit phosphoric và acetol
- Cách làm: Bản sắc ký phải đ−ợc sấy khô tr−ớc khi thực hiện thí nghiệm. Mẫu thí nghiệm đ−ợc chấm lên giấy với l−ợng khoảng 0,5àl, đem sấy khô rồi để mẫu chạy trong 4 giờ. Sau khi kết thúc quá trình chạy bản sắc ký đ−ợc phun chất hiện màu rồi sấy khô.
2.3.2.4 Xác định thành phần đ−ờng bằng sắc ký lỏng cao áp
Thành phần các loại đ−ờng đ−ợc xác định chính xác bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Điều kiện chạy nh− sau:
- Nồng độ đ−ờng: 5 g/l - L−ợng mẫu : 20 àl - Nhiệt độ : 80 0C
- Pha động : axit trong n−ớc có pH = 2.5 - Tốc độ : 1,2 ml/ phút