- Đ−ờng kính: đ−ờng kính Lam Sơn loại I, mua tại các siêu thị và cửa hàng thực phẩm Việt Nam;
- Aga, cao nấm men: Trung Quốc. - Đất trợ lọc : Sigma, Mỹ.
- Than hoạt tính: Sigma, Mỹ.
- Bản mỏng sắc ký TLC silica gel 60 F 254: Merck, Đức. - Hạt trao đổi ion: Trung Quốc.
- Các loại nguyên liệu khác: Mua tại thị tr−ờng Việt Nam
2.1.4 Hoá chất
- Glucoza, fructoza tiêu chuẩn : Trung Quốc. - Nystoza, kestoza tiêu chuẩn : Fluka, Nhật Bản.
- N-propynol, ethylacetat, diphenylamin, anilin, axit photphoric, dinitrihipophotphat, axit citric, pepton, magesulphat, kalihipophotphat của Công ty hoá chất Y d−ợc, Th−ợng Hải, Trung Quốc.
- Các loại hoá chất khác có độ tinh khiết cho phân tích sắc ký và phân tích, đ−ợc mua tại thị tr−ờng hoá chất Trung Quốc và Việt Nam.
2.2 Các thiết bị chủ yếu
- Thiết bị nuôi cấy và lên men. + Tủ sấy: Sanyo , Nhật Bản. + Tủ cấy vô trùng: Việt Nam. + Tủ ấm: Trung Quốc
+ Máy lắc ổn tốc, ổn nhiệt: Việt Nam + Tủ lạnh: Sanyo, Nhật.
- Thiết bị phản ứng
+ Nồi cách thuỷ ổn nhiệt: Lauda, Đức.
+ Thiết bị khuấy từ gia nhiệt: HB4 basic Malaysia. + Thiết bị cô chân không: B⎫chi Potavapor R-114. + Thiết bị đo pH ORION, model 410A.
- Thiết bị phân ly
+ Cột sắc ký trao đổi ion : φ 4,5cm x 50cm Th−ợng Hải, Trung Quốc. - Thiết bị phân tích
+ Hệ thống thiết bị sắc ký lỏng cao áp HPLC: Nhật Bản + Máy so màu Genesis, Mỹ.
+ Chiết quang kế: Trung Quốc. - Thiết bị công nghệ
+ Dây chuyền sản xuất bột dinh d−ỡng trẻ em: Viện Công nghiệp thực phẩm
+ Dây chuyền sản xuất bánh hích quy và kẹo: Công ty thực phẩm Hà Tây + Dây chuyền sản xuất bánh hích quyvà kẹo: Cơ sở sản xuất bánh kẹo Phúc Long
2.3 Ph−ơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Ph−ơng pháp vi sinh vật 2.3.1 Ph−ơng pháp vi sinh vật 2.3.1 Ph−ơng pháp vi sinh vật 2.3.1.1 Phân lập, tuyển chọn giống
- Phân lập theo ph−ơng pháp pha loãng, nuôi cấy trên môi tr−ờng khoai tây.
- Phân lập theo hoạt lực của enzim [8].
2.3.1.2 Môi tr−ờng nuôi cấy vi sinh vật
- Môi tr−ờng n−ớc chiết khoai tây [8] : 200 g/l khoai tây, 20g/l đ−ờng kính, 20 g/l aga, pH 6,0. Thanh trùng ở áp lực1kg/cm2 trong 20 phút.
- Môi tr−ờng nhân giống: đ−ờng kính 150 g/l, cao nấm men 5 g/l, pepton 10 g/l; MgSO4.7H2O 1 g/l, KH2PO4 0,5 g/l, pH 6,5. Thanh trùng ở áp lực 1 kg/cm2 trong 20 phút.
- Môi tr−ờng lên men: 150 g/l đ−ờng kính, 5 g/l cao nấm men, 10 g/lpepton, 1 g/l MgSO4.7H2O, 0,5 g/l KH2PO4, pH 6,5. Thanh trùng ở áp lực 1 kg/cm2
trong 20 phút.
- Môi tr−ờng n−ớc chiết malt: 10 – 11 0Bx n−ớc chiết malt, 2-2,5% agar, 0,3 % pepton, pH 5,6. Thanh trùng ở áp lực 1 kg/cm2 trong 20 phút.
- Môi tr−ờng Czapek: 30 g/l đ−ờng kính, 0,2 % tinh bột, 0,001% FeSO4, 0,05 % MgSO4, 0,05 % KCl, 0,1 % KH2PO4, 0,3 % NaNO3, 2,5 % agar. Thanh trùng ở áp lực 1 kg/cm2 trong 20 phút.
2.3.1.3 Nuôi cấy vi sinh vật [2], [1]
- Nuôi cấy trên hộp lồng: nhiệt độ 30 0C trong 48 giờ .
- Nuôi cấy trên ống thạch nghiêng: nhiệt độ 30 0C trong 3 ngày.
- Nuôi cấy giống cấp 1: nuôi trong bình tam giác 500 ml có chứa 50 ml dịch, lên men trên máy lắc với tần số 200 vòng/ phút, biên độ 10 mm, nhiệt độ 30
0
C trong thời gian 24 giờ.
2.3.1.4 Ph−ơng pháp phân loại và định tên vi sinh vật
Quá trình phân loại của chủng nấm mốc VVTP 84 đ−ợc tiến hành bằng cách nuôi cấy vi sinh vật trên ba môi tr−ờng đặc tr−ng đó là môi tr−ờng n−ớc chiết khoai tây, môi tr−ờng Czapek và môi tr−ờng n−ớc chiết malt. Vi sinh vật đ−ợc
quan sát theo dõi trong suốt thời gian nuôi cấy bằng mắt th−ờng, kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử. Cuối cùng vi sinh vật đ−ợc xác định tên dựa trên các khoá phân loại thích ứng.
2.3.1.5 Lên men tổng hợp enzim
Lên men chìm trong bình tam giác: bình tam giác 250 ml có chứa 30 ml dịch hoặc bình tam giác 500 ml chứa 50 ml dịch trong đ−ợc lên men trên máy lắc với tần số 200 vòng/phút, biên độ 10 mm, nhiệt độ 30 0C trong thời gian 36 giờ.
2.3.2 Các ph−ơng pháp hoá sinh, hoá lý 2.3.2.1 Chiết tách enzim [8] 2.3.2.1 Chiết tách enzim [8] 2.3.2.1 Chiết tách enzim [8]
- Xử lý sinh khối: Sinh khối thu đ−ợc sau lên men đ−ợc rửa sạch bằng n−ớc cất và dung dịch đệm Mcllvaine (muối photphat natri - axit citric) 0,1 M pH5.
- Phá vỡ tế bào : Sử dụng 3 ph−ơng pháp là nghiền bi, đồng hoá siêu tốc và siêu âm. Cả 3 ph−ơng pháp trên đều dùng dung dịch đệm Mcllvaine (muối phốt phát natri- axit citric) 0,1M pH= 5.
- Chiết tách enzim: Sau khi phá vỡ tế bào, hỗn dịch đ−ợc ngâm 3 giờ ở nhiệt độ 40C. Cuối cùng enzim thô đ−ợc tách ra từ hỗn dịch bằng cách lọc chân không, hoặc li tâm lạnh. Enzim thô sau đó đ−ợc đem phân tích hoạt lực. Quá trình tuyển chọn giống sẽ căn cứ vào hoạt lực của enzim.
2.3.2.2 Xác định hoạt lực enzim
Hoạt lực của enzim đ−ợc xác định theo ph−ơng pháp của Hidaka cải tiến [29]. Ph−ơng pháp này đ−ợc tiến hành nh− sau: dịch phản ứng chứa 25% đ−ờng sacaroza (10ml), dung dịch đệm pH 5 (5ml), enzim thô 0,5ml. Phản ứng xảy ra trong thời gian 1giờ ở nhiệt độ 50oC. Kết thúc phản ứng enzim đ−ợc bất hoạt trong n−ớc sôi 10 phút. Hoạt tính UH và UT đ−ợc xác định thông qua l−ợng đ−ờng kestoza và fructoza t−ơng ứng đ−ợc tạo thành sau phản ứng. Một đơn vị hoạt lực đ−ợc định nghĩa là l−ợng enzim cần thiết cho sự tạo thành 1 àmol đ−ờng t−ơng ứng trong thời gian 1 phút d−ới điều kiện phản ứng nh− trên.
Trong quá trình sơ tuyển giống thì hoạt lực enzim đ−ợc sơ bộ xác định thông qua sắc ký bản mỏng.
2.3.2.3 Xác định thành phần đ−ờng (định tính) bằng sắc ký bản mỏng
Sắc ký bản mỏng đ−ợc làm theo ph−ơng pháp của Jiang Bo. Cách làm đ−ợc tiến hành nh− sau:
- Dung dịch chạy: n-propynol : ethylacetate : n−ớc cất ( 7/1/2).
- Chất hiện màu: Dung dịch difenylamin, benzoamin, axit phosphoric và acetol
- Cách làm: Bản sắc ký phải đ−ợc sấy khô tr−ớc khi thực hiện thí nghiệm. Mẫu thí nghiệm đ−ợc chấm lên giấy với l−ợng khoảng 0,5àl, đem sấy khô rồi để mẫu chạy trong 4 giờ. Sau khi kết thúc quá trình chạy bản sắc ký đ−ợc phun chất hiện màu rồi sấy khô.
2.3.2.4 Xác định thành phần đ−ờng bằng sắc ký lỏng cao áp
Thành phần các loại đ−ờng đ−ợc xác định chính xác bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Điều kiện chạy nh− sau:
- Nồng độ đ−ờng: 5 g/l - L−ợng mẫu : 20 àl - Nhiệt độ : 80 0C
- Pha động : axit trong n−ớc có pH = 2.5 - Tốc độ : 1,2 ml/ phút
2.3.2.5 Phân tích đ−ờng khử
Theo ph−ơng pháp DNS. Ph−ơng pháp làm nh− sau:
Pha dung dịch 3,5 – dinitrosalicytic acit (dung dịch A): 6,5 g 3,5 – dinitrosalicytic axit + 325 ml dung dịch 2 M NaOH + 45 g glycerol đem hoà đều và định mức với n−ớc cất thành 1000 ml.
Cách xác định :
Dựng đ−ờng chuẩn: cho vào các bình định mức 25 ml mỗi bình 1 ml dung dịch 0,1,2,3,4,5,6,7 mg/ml glucoza tiêu chuẩn và 2ml dung dịch A, đun sôi trong n−ớc 2 phút để hiện màu. Sau đó làm nguội nhanh và dùng n−ớc cất định mức đến 25ml, trộn đều và đem đo độ hấp thụ quang trên máy so màu ở b−ớc sóng 540nm. Dựng đ−ờng chuẩn .
Phân tích mẫu: thay thế đ−ờng glucoza tiêu chuẩn bằng mẫu thí nghiệm rồi tiến hành t−ơng tự nh− trên để xác định độ hấp thụ quang của mẫu thí nghiệm rồi căn cứ vào đ−ờng chuẩn để xác định hàm l−ợng đ−ờng glucoza.
2.3.2.6 Phân tích hoá lý theo các ph−ơng pháp thông dụng
- Phân tích đạm theo ph−ơng pháp Kjeldahl
- Phân tích béo theo ph−ơng pháp chiết bằng máy Soxlet
- Phân tích ẩm bằng ph−ơng pháp sấy đến trọng l−ợng không đổi - Phân tích gluxit bằng ph−ơng pháp enzim
2.3.3 Ph−ơng pháp toán học
Sử dụng ph−ơng pháp qui hoạch thực nghiệm Box - Wilson [76]
2.3.4 Ph−ơng pháp đánh giá cảm quan
Sử dụng ph−ơng pháp cảm quan cho điểm theo thứ tự. Theo ph−ơng pháp này số ng−ời đ−ợc mời đến bình xét mẫu là 15 (hoặc hơn). Căn cứ vào mức độ hấp dẫn của sản phẩm các chuyên gia cảm quan này sẽ xếp hạng sản phẩm theo thứ tự vào phiếu bình xét của mình. Dựa vào kết quả cảm quan của các chuyên gia, dùng ph−ơng pháp tổng hợp và tra bảng sẽ tìm ra những sản phẩm có độ hấp dẫn nhất.
2.3.5 Các công nghệ và quá trình cơ sở
2.3.5.1 Quy trình sản xuất enzim fructoosyltransferaza
Nguyên liệu ––––> Phối trộn ––––> Lên men ––––> Tách sinh khối
––––> Phá vỡ tế bào ––––> Trích ly enzim thô.
2.3.5.2 Công nghệ sản xuất FOS cao độ bằng ph−ơng pháp đồng thời
Nguyên liệu ––––> Phối trộn ––––> Phản ứng enzim ––––> lọc ––––> Làm sạch ––––> Cô đặc.
2.3.5.3 Công nghệ sản xuất FOS cao độ bằng ph−ơng pháp nối tiếp
Nguyên liệu ––––> Phối trộn ––––> Phản ứng chuyển hoá đ−ờng sacaroza
–––> Phản ứng chuyển hoá đ−ờng glucoza ––––> lọc ––––> Làm sạch ––––> Cô đặc.
Ch−ơng 3
Kết quả và thảo luận
3.1 Nghiên cứu sản xuất đ−ờng FOS cao độ bằng ph−ơng pháp nối tiếp
Ph−ơng pháp nối tiếp đ−ợc phân ra làm hai phân đoạn: phân đoạn phản ứng FTS và phân đoạn phản ứng GOD - CAT. Tại phân đoạn 1, enzim FTS xúc tác lên đ−ờng sacaroza tạo ra đ−ờng FOS và đ−ờng glucoza. Còn tại phân đoạn 2 hệ 2 enzim GOD - CAT tác dụng lên đ−ờng glucoza và chuyển hoá chúng thành axit gluconic rồi thành muối gluconat natri và đ−ợc loại ra khỏi dung dịch bằng cách trao đổi ion. Để có đ−ợc hiệu quả cao, để đạt đ−ợc mục đích có đ−ờng FOS cao độ. Cả hai điều kiện chuyển hoá trên phải đ−ợc nghiên cứu tối −u ho
3.1.1 ảnh h−ởng của pH môi tr−ờng đến hoạt lực của FTS
Trong phản ứng có enzim, độ axit hoặc kiềm của môi tr−ờng có vai trò rất quan trọng, nó ảnh h−ởng không những đến hoạt lực của enzim mà còn ảnh h−ởng đến cấu hình enzim, từ đó ảnh h−ởng đến các tính năng khác của enzim nh− tính đặc hiệu ( chỉ xúc tác phân cắt hay gắn kết ở những mối liên kết nhất định), đến khả năng phân li các phân tử của cơ chất và enzim, đến lực liên kết giữa enzim và cơ chất, đến độ ổn định của enzim v.v… Nếu pH của dịch thuỷ phân quá xa với khoảng thích hợp sẽ làm bất hoạt enzim.
Vì thế việc xác định pH tối −u và khoảng pH mà ở đó enzim không bị thay đổi các đặc tính của mình (ổn định) là việc cần thiết tr−ớc khi sử dụng. Để xác định pH tối −u cho hoạt động của enzim, thí nghiệm đ−ợc tiến hành bằng cách xác định hoạt lực của các mẫu enzim trong điều kiện pH khác nhau từ 3 tới 10. Hình 3.1 là kết quả cho thấy mối liên quan của pH môi tr−ờng với hoạt lực của enzim. Ta dễ dàng nhận thấy hoạt lực của enzim đạt giá trị cao nhất khi pH của môi tr−ờng là 5.0. So sánh với các kết quả đã công bố thì kết quả này cũng phù hợp vì hầu hết các FTS đều có pH tối −u cho hoạt động là từ 5.0 đến 6.8 nh− FTS của Aspergillus
japonicus [10], Aspergillus niger ATCC20611 [30], Aureobasidium pullulas [34]. Chỉ duy nhất có FTS từ Aspergillus oryzae [34] là có hoạt lực tối đa tại pH 8.
3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 3 5 7 9 11 pH Hoạt lực (U/ml)
Hình 3.1: ảnh h−ởng của pH đến hoạt lực của enzim
Để xác định khoảng pH mà tại đó FTS ổn định (các đặc tính không bị thay đổi), thí nghiệm đ−ợc tiến hành bằng cách ngâm các mẫu enzim vào những môi tr−ờng có pH khác nhau thay đổi trong khoảng 3 đến 10 trong thời gian 2 giờ. Sau đó hoạt lực của enzim đ−ợc đem phân tích để xác định hoạt lực t−ơng đối (tỷ lệ phần trăm hoạt lực của enzim sau và tr−ớc khi bị xử lý). Kết quả nh− hình 3.2 đã thể hiện. Ta thấy enzim FTS ổn định trong dải pH khá dài từ 4 đến 10.
0 20 40 60 80 100 120 3 5 7 9 pH Hoạt lực t − ơng đối (%) 11
Hình 3.2: ảnh h−ởng của pH đến sự ổn định hoạt lực của enzim
3.1.2 ảnh h−ởng của nhiệt độ đến sự ổn định hoạt lực của enzim
Cũng nh− pH nhiệt độ môi tr−ờng phản ứng có ảnh h−ởng rất lớn đến tính chất cũng nh− hoạt lực của enzim. Để xác định nhiệt độ tối −u cho hoạt động của enzim, chúng tôi tiến hành xác định hoạt lực của enzim ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau từ 40 oC đến 60 oC. Thí nghiệm giữ enzim trong nồi cách thuỷ ở những nhiệt độ khác nhau trong thời gian 1 giờ đã xác định đ−ợc độ bền nhiệt của enzim. Kết quả đ−ợc trình bày trên đồ thị hình 3.3. Ta thấy enzim có hoạt lực cao nhất khi ở nhiệt độ 50oC và enzim này t−ơng đối ổn định trong dải nhiệt từ 35 oC đến 55oC. Kết quả này cũng phù hợp với các công bố của Jiang Bo [8] khi tác giả nghiên cứu FTS thu nhận từ Aspergillus niger AS0023.
20 40 60 80 100 120 25 35 45 55 65 Nhiệt độ (0C) Hoạt lực t − ơng đối (%) 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Hoạt lực tuyệt đối (U/ml)
Hoạt lực t−ơng đối Hoạt lực tuyệt đối
Hình 3.3: ảnh h−ởng của nhiệt độ đến hoạt lực của enzim
3.1.3 Tối −u hoá các điều kiện chuyển hoá FOS
Qui hoạch toán học thực nghiệm là ph−ơng pháp đ−ợc ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực nghiên cứu, đặc biệt là trong lĩnh vực công nghệ sinh học, bởi ph−ơng pháp này có thể giảm số lần thí nghiệm tới mức tối thiểu mà vẫn cho kết quả chính xác. Trong phản ứng có enzim xúc tác, hiệu suất của phản ứng bị ảnh h−ởng bởi nhiều yếu tố nh− nhiệt độ, pH, thời gian, nồng độ enzim, nồng độ cơ chất v.v…, nên việc xác định điều kiện tối −u cho quá trình là rất phức tạp. Việc sử dụng
ph−ơng pháp qui hoạch toán học thực nghiệm sẽ giúp ta dễ dàng hơn trong quá trình thí nghiệm. Trong nghiên cứu này ph−ơng pháp qui hoạch thực nghiệm Box- Willson đã đ−ợc chọn. Các yếu tố cần tối −u là nồng độ sacaroza (%), nồng độ enzim FTS (U/g sacaroza), thời gian phản ứng (giờ), chỉ tiêu tối −u là hàm l−ợng FOS tạo thành (%). Tất cả các thí nghiệm đều đ−ợc tiến hàmh ở điều kiện nhiệt độ 50 0C và pH 5 thích hợp cho hoạt động của enzim. Mục đích của quá trình là tìm điều kiện phản ứng để thu đ−ợc hiệu suất cao nhất, tức thu đ−ợc hàm l−ợng FOS cao nhất.
Theo ph−ơng pháp đã dẫn, quá trình tối −u hoá đ−ợc thực hiện theo tiến trình sau:
B−ớc 1: Xây dựng mô hình toán học
• Xác định các chỉ tiêu tối −u và các yếu tố ảnh h−ởng. Chỉ tiêu cần tối −u: y= f(x1, x2, x3)
Trong đó:
y –– Hàm l−ợng FOS thu đ−ợc sau thuỷ phân (%). x1 –– Nồng độ cơ chất (sacaroza): từ 40 % đến 60 %. x2 –– Nồng độ FTS : từ 5U/g cơ chất đến 15U/g cơ chất. x3 –– Thời gian thuỷ phân : từ 5h - đến15h.
Bảng 3.1: Mức thí nghiệm của các yếu tố
Các mức của biến số Biến số Mức d−ới (-) Mức trung bình (0) Mức trên (+) Khoảng thay đổi X1: Nồng độ cơ chất (%) 40 50 60 10 X2: Nồng độ enzim (U/g cơ chất) 5 10 15 5
X3 : Thời gian (giờ) 5 10 15 5
• Mức thí nghiệm của các yếu tố đ−ợc ghi trên bảng 3.1.
• Xây dựng ma trận thực nghiệm: ma trận thực nghiệm đ−ợc thiết lập với số thí nghiệm: N=2n=23=8 (n- số yếu tố ảnh h−ởng).
Ma trận thực nghiệm và kết quả thực nghiệm đ−ợc ghi trong bảng 3.11.
Bảng 3.2: Ma trận thực nghiệm và kết quả TT x1 x2 x3 y1 y2 y3 ytb S2 j.