2.3.2.1 Chiết tách enzim [8]
- Xử lý sinh khối: Sinh khối thu đ−ợc sau lên men đ−ợc rửa sạch bằng n−ớc cất và dung dịch đệm Mcllvaine (muối photphat natri - axit citric) 0,1 M pH5.
- Phá vỡ tế bào : Sử dụng 3 ph−ơng pháp là nghiền bi, đồng hoá siêu tốc và siêu âm. Cả 3 ph−ơng pháp trên đều dùng dung dịch đệm Mcllvaine (muối phốt phát natri- axit citric) 0,1M pH= 5.
- Chiết tách enzim: Sau khi phá vỡ tế bào, hỗn dịch đ−ợc ngâm 3 giờ ở nhiệt độ 40C. Cuối cùng enzim thô đ−ợc tách ra từ hỗn dịch bằng cách lọc chân không, hoặc li tâm lạnh. Enzim thô sau đó đ−ợc đem phân tích hoạt lực. Quá trình tuyển chọn giống sẽ căn cứ vào hoạt lực của enzim.
2.3.2.2 Xác định hoạt lực enzim
Hoạt lực của enzim đ−ợc xác định theo ph−ơng pháp của Hidaka cải tiến [29]. Ph−ơng pháp này đ−ợc tiến hành nh− sau: dịch phản ứng chứa 25% đ−ờng sacaroza (10ml), dung dịch đệm pH 5 (5ml), enzim thô 0,5ml. Phản ứng xảy ra trong thời gian 1giờ ở nhiệt độ 50oC. Kết thúc phản ứng enzim đ−ợc bất hoạt trong n−ớc sôi 10 phút. Hoạt tính UH và UT đ−ợc xác định thông qua l−ợng đ−ờng kestoza và fructoza t−ơng ứng đ−ợc tạo thành sau phản ứng. Một đơn vị hoạt lực đ−ợc định nghĩa là l−ợng enzim cần thiết cho sự tạo thành 1 àmol đ−ờng t−ơng ứng trong thời gian 1 phút d−ới điều kiện phản ứng nh− trên.
Trong quá trình sơ tuyển giống thì hoạt lực enzim đ−ợc sơ bộ xác định thông qua sắc ký bản mỏng.
2.3.2.3 Xác định thành phần đ−ờng (định tính) bằng sắc ký bản mỏng
Sắc ký bản mỏng đ−ợc làm theo ph−ơng pháp của Jiang Bo. Cách làm đ−ợc tiến hành nh− sau:
- Dung dịch chạy: n-propynol : ethylacetate : n−ớc cất ( 7/1/2).
- Chất hiện màu: Dung dịch difenylamin, benzoamin, axit phosphoric và acetol
- Cách làm: Bản sắc ký phải đ−ợc sấy khô tr−ớc khi thực hiện thí nghiệm. Mẫu thí nghiệm đ−ợc chấm lên giấy với l−ợng khoảng 0,5àl, đem sấy khô rồi để mẫu chạy trong 4 giờ. Sau khi kết thúc quá trình chạy bản sắc ký đ−ợc phun chất hiện màu rồi sấy khô.
2.3.2.4 Xác định thành phần đ−ờng bằng sắc ký lỏng cao áp
Thành phần các loại đ−ờng đ−ợc xác định chính xác bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Điều kiện chạy nh− sau:
- Nồng độ đ−ờng: 5 g/l - L−ợng mẫu : 20 àl - Nhiệt độ : 80 0C
- Pha động : axit trong n−ớc có pH = 2.5 - Tốc độ : 1,2 ml/ phút
2.3.2.5 Phân tích đ−ờng khử
Theo ph−ơng pháp DNS. Ph−ơng pháp làm nh− sau:
Pha dung dịch 3,5 – dinitrosalicytic acit (dung dịch A): 6,5 g 3,5 – dinitrosalicytic axit + 325 ml dung dịch 2 M NaOH + 45 g glycerol đem hoà đều và định mức với n−ớc cất thành 1000 ml.
Cách xác định :
Dựng đ−ờng chuẩn: cho vào các bình định mức 25 ml mỗi bình 1 ml dung dịch 0,1,2,3,4,5,6,7 mg/ml glucoza tiêu chuẩn và 2ml dung dịch A, đun sôi trong n−ớc 2 phút để hiện màu. Sau đó làm nguội nhanh và dùng n−ớc cất định mức đến 25ml, trộn đều và đem đo độ hấp thụ quang trên máy so màu ở b−ớc sóng 540nm. Dựng đ−ờng chuẩn .
Phân tích mẫu: thay thế đ−ờng glucoza tiêu chuẩn bằng mẫu thí nghiệm rồi tiến hành t−ơng tự nh− trên để xác định độ hấp thụ quang của mẫu thí nghiệm rồi căn cứ vào đ−ờng chuẩn để xác định hàm l−ợng đ−ờng glucoza.
2.3.2.6 Phân tích hoá lý theo các ph−ơng pháp thông dụng
- Phân tích đạm theo ph−ơng pháp Kjeldahl
- Phân tích béo theo ph−ơng pháp chiết bằng máy Soxlet
- Phân tích ẩm bằng ph−ơng pháp sấy đến trọng l−ợng không đổi - Phân tích gluxit bằng ph−ơng pháp enzim