3.2.1 Thời gian
Đề tài được thực hiện từ tháng 8 năm 2014 đến tháng 6 năm 2021.
3.2.2 Địa điểm
Đề tài được thực hiện tại các các tỉnh Đồng bằng Sơng Cửu Long: An Giang, Bạc Liêu, Cà Mau, TP. Cần Thơ, Đồng Tháp, Hậu Giang, Kiên Giang, Sĩc Trăng, Trà Vinh, Vĩnh Long, Long An, Tiền Giang và Bến Tre.
Các mẫu khảo sát được tiến hành xét nghiệm tại các phịng thí nghiệm: Bộ mơn Thú y, trường Đại học Cần Thơ; Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển, cơng ty Vemedim Cần Thơ; Chi cục Thú y vùng VI thành phố Hồ Chí Minh; Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh.
3.3 Vật liệu nghiên cứu
3.3.1 Mẫu vật dùng trong nghiên cứu
Mẫu dùng để khảo sát đánh giá tỷ lệ bảo hộ, đáp ứng miễn dịch sau tiêm phịng bệnh dại và khả năng tồn trữ mầm bệnh dại ngồi tự nhiên là mẫu máu (huyết thanh) của chĩ, mèo và một số động vật hoang dã (chuột cống, sĩc nhen, dơi).
42
Hình 3.1: Động vật hoang dã (chuột, sĩc nhen, dơi) được lấy mẫu
Mẫu dùng để khảo sát mối tương quan di truyền giữa các chủng virus dại thực địa với chủng vaccine đang sử dụng (93127FRA (GU992320.1, Pháp) và sadWistar_3_var01 (LN713659, Đức)) và các chủng virus dại trong khu vực ((U0520629 (KM366216.1), V0808656 (KM366221.1) và V0627625 (KM366222.1)) là mẫu não (sừng Amon, tiểu não, bán cầu não) của động vật nghi mắc bệnh dại.
43
Mẫu não của động vật nghi mắc bệnh dại được lấy như sau: từ thơng tin của tất cả Thú y của các tỉnh ĐBSCL về triệu chứng lâm sàng trên động vật nghi mắc bệnh dại, sau đĩ xin ý kiến lấy mẫu của cơ quan Thú y cĩ thẩm quyền tại địa phương. Tiếp theo con vật được xử lý và lấy đầu sau đĩ bỏ vào 3 lớp ni lon rồi đem trữ trong thùng đá và vận chuyển ngay đến Chi cục Thú y vùng VI ở TP.HCM để chẩn đốn xét nghiệm.
3.3.2 Hĩa chất và sinh phẩm chính sử dụng trong nghiên cứu
Các hĩa chất và sinh phẩm được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Kháng thể kháng Nucleocapside virus dại gắn huỳnh quang (Bio-Rad cung cấp) (Bảo quản ở 2- 8oC), dung dịch Glycerol buffer (Bảo quản ở 2-8oC), dung dịch đệm phosphate pH 7,4 (PBSx10), glycerine, Evans Blue 1% (Bio-Rad cung cấp) (Bảo quản ở 2-8oC), nước cất, acetone, cồn, crezyl, NaCl, KH2PO4, Tampon (PBS 10X của Bio-rad cung cấp), tiêu bản dương tính, âm tính, bộ kit SERELISA®Rabies Ab Mono Indirect (Pháp), bộ kit chiết xuất QIAamp* Viral RNA Mini Kit (Cat.No 52904), QIAquick ® PCR Purification kit, (hãng Qiagen), Cat. 28104, Kit QIAquick Gel Extraction kit, (hãng Qiagen), cat:28704……
3.3.3 Trang thiết bị, dụng cụ chính sử dụng trong nghiên cứu
Thiết bị: Autoclave, tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh -20oC, tủ ấm 37oC, máy ly tâm, máy
Real time PCR, máy ELISA, máy vortex, đèn cực tím, buồng cấy vơ trùng (Biosafety cabinet Class II), máy đo bước sĩng hiệu BIO-TEX (Mỹ) model Epoch, Hệ thống điện di Gelmate 2000 (Toyobo), máy chụp hình gel Chemdoc XRS, máy luân nhiệt Minicycler (MJ Research), máy giải trình tự 3130 genetic analyzer…
Hình 3.2: Hệ thống máy ELISA (máy rửa, máy ủ, máy đọc)
44
Hình 3.3: Máy giải trình tự gen
Hình 3.4: Hệ thống Real time PCR (Viện Pasteur TP. HCM, 2020)
Hình 3.5: Tủ cấy an tồn sinh học cấp II
45
Hình 3.6: Máy ly tâm Hermle
Dụng cụ: Ống nghiệm nút vặn, đĩa Petri, bình tam giác, đèn cồn, lam kháng
acetone, Lammel, giấy thấm, kẹp giải phẫu, pen, kéo, tube Eppendorf (Rnase/Dnase free), Micropipette đơn: 0,5 - 10 µl, 2 - 20 µl, 20 - 200 µl, 200 - 1000 µl, đầu tube cĩ lọc: 10 µl, 20 µl, 200 µl, 1000 µl, Micropipette đa kênh…
3.3.4 Biểu mẫu thu thập thơng tin
Nghiên cứu tiến hành thu thập thơng tin thơng qua các biểu mẫu được thể hiện qua phụ lục, bao gồm:
- Phiếu điều tra tổng đàn chĩ, tỷ lệ tiêm phịng, tỷ lệ chĩ mắc bệnh dại các năm từ 2017 đến 2020 và tình hình tiêm phịng dại trên người do chĩ, mèo cắn (cào);
- Phiếu lấy mẫu máu xét nghiệm kháng thể kháng virus dại;
- Phiếu khảo sát cộng đồng về bệnh dại.
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp điều tra tình hình tiêm phịng và bệnh dại ở chĩ và tìnhhình tiêm phịng bệnh dại trên người từ 2017 đến 2020. hình tiêm phịng bệnh dại trên người từ 2017 đến 2020.
Phương pháp dịch tễ học mơ tả (điều tra hồi cứu, điều tra cắt ngang và phỏng vấn trực tiếp) được tiến hành thơng qua các phiếu điều tra (phụ lục) tại 13 tỉnh/thành ĐBSCL để thu thập các số liệu sau:
- Tổng đàn chĩ từ các năm 2017 - 2020;
- Tỷ lệ tiêm phịng dại chĩ 2017 - 2020;
- Tình hình tiêm phịng dại trên người do chĩ, mèo cắn (cào);
- Tình hình bệnh dại trên chĩ và người.
Ngồi ra, số liệu cịn được thu thập từ các cơ quan như Chi cục Chăn nuơi và Thú y, Trung tâm y tế dự phịng, Cục thống kê, các bệnh viện và các hộ nuơi chĩ, mèo tại 13
46
tỉnh/thành ĐBSCL (TP. Cần Thơ, Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Kiên Giang, Đồng Tháp, Hậu Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh, Sĩc Trăng, Bạc Liêu, An Giang và Cà Mau).
3.4.2 Phương pháp khảo sát nhận thức của cộng đồng về bệnh dại
Để khảo sát nhận thức chủ vật nuơi về bệnh dại, tiến hành lập phiếu khảo sát (phụ lục 2) và thực hiện khảo sát các hộ nuơi trên thực địa để thu thập và thống kê các thơng tin như:
- Hiểu biết bệnh dại là truyền chủ yếu từ chĩ;
- Bệnh dại cĩ gây chết người;
- Cần phải tiêm phịng dại cho chĩ,
- Tiêm phịng dại đúng lịch cho chĩ;
- Gia đình cĩ người bị chĩ cắn;
- Số trẻ em nhỏ hơn 15 tuổi bị chĩ cắn;
- Tiêm phịng dại sau khi bị chĩ cắn, …
3.4.3 Khảo sát sự hiện diện của kháng thể kháng virus dại trên đàn chĩ, mèo thả rơng và tại điểm giết mổ
Khảo sát tỷ lệ bảo hộ của chĩ, mèo thả rơng và tại điểm giết mổ đối với virus bệnh dại bằng phương pháp điều tra cắt ngang thơng qua việc lấy máu của chĩ, mèo thả rơng và tại nơi thu gom chĩ (mèo) để kiểm tra hiệu giá kháng thể chống virus dại tại các địa phương TP. Cần Thơ, Bến Tre.
Bến Tre là một trong 13 tỉnh/thành vùng ĐBSCL với đặc thù là một tỉnh cù lao, hệ thống sơng ngịi chằng chịt, tỉnh cĩ tổng đàn chĩ lớn nhất vùng ĐBSCL nhưng tỷ lệ tiêm phịng dại cho chĩ lại thấp hơn 10%. Chính vì vậy, nghiên cứu tập trung lấy mẫu huyết thanh trên chĩ chưa tiêm phịng thả rơng ở 01 thành phố (TP. Bến Tre), 05 huyện (Giồng Trơm, Châu Thành, Ba Tri, Mỏ Cày Nam, Chợ Lách) thuộc tỉnh Bến Tre, mẫu được lấy ngẫu nhiên phi xác suất và được bố trí thu mẫu cụ thể được trình bày ở Bảng 3.1.
47
Bảng 3.1: Bố trí lấy mẫu máu chĩ nuơi (thả rơng) tại Bến Tre Khu vực
Nội ơ
Ngoại ơ
Tổng cộng
Cần Thơ là thành phố lớn, hiện đại và phát triển bậc nhất ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long, thành phố lớn thứ 4 cả nước, đồng thời là một đơ thị loại 1, thành phố trực thuộc Trung ương. Cần Thơ cịn là trung tâm cơng nghiệp, thương mại - dịch vụ, giáo dục - đào tạo và khoa học - cơng nghệ, y tế và văn hĩa của vùng ĐBSCL, là địa phương cĩ tổng đàn chĩ thấp nhất vùng ĐBSCL nhưng tỷ lệ tiêm phịng dại đạt trên 80% trong những năm gần đây. Chính vì vậy, mẫu máu của chĩ được lấy tại nơi thu gom tại 6 quận/huyện thuộc TP. Cần Thơ; Đối với mẫu máu mèo (59 mẫu) chỉ được lấy ngẫu nhiên ở một số nơi thu gom mèo (quán tiểu Hổ) tại TP. Cần Thơ. Mẫu khảo sát ở TP. Cần Thơ được thu thập và bố trí theo Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Bố trí lấy mẫu máu chĩ, mèo tại nơi thu gom ở TP. Cần Thơ
Khu vực
Nội thành
Ngoại thành
Tổng cộng
a. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu máu chĩ được lấy sau khi chĩ được khớp mõm, cố định các chân. Đầu tiên cần cắt lơng, sát trùng tại vị trí lấy mẫu (tĩnh mạch chân trước hoặc tĩnh mạch chân sau) cho chĩ, mèo sau đĩ thắt dây garo (hoặc cĩ thể dùng tay) chặn phần trên của tĩnh mạch cần lấy để lộ rõ mạch máu; dùng tay thuận (tay phải) đưa kim 23G của ống tiêm nhựa nhẹ nhàng vào mạch để lấy máu (khoảng 2 - 3 ml máu/con). Sát trùng và cầm máu sau khi lấy máu.
Mẫu máu sau khi lấy được cho vào ống trữ đơng máu, ký hiệu mẫu, rồi trữ lạnh bằng thùng đá, và để đơng tự nhiên, sau đĩ ly tâm 3.500 vịng/phút trong 5 phút để tách huyết thanh. Huyết thanh thu được cho vào ống eppendorf 1,5ml đã được ký hiệu mẫu.
Mẫu huyết thanh tiếp tục được bảo quản lạnh rồi vận chuyển về phịng thí nghiệm, mẫu huyết thanh trữ lạnh ở 2 - 8oC đảm bảo sử dụng trong vịng 5 ngày và ở -20oC nếu sử dụng quá 5 ngày. Đối với mẫu cấp đơng ở -20oC khi xét nghiệm phải rã đơng, chuyển xuống ngăn mát của tủ và trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Phương pháp ELISA
Mẫu máu sau khi lấy được phân tích đánh giá bằng phương pháp dịch tễ học phân tích. Mẫu được xét nghiệm bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp để xác định hàm lượng kháng thể dại trên chĩ, mèo và một số động vật hoang, bộ kit được sử dụng là SERELISA®Rabies Ab Mono Indirect (Pháp) và được đọc trên máy đo bước sĩng (BIO-TEX, model Epoch của Mỹ) để phát hiện kháng thể dại.
Hình 3.7: Bộ kit phản ứng ELISA và máy đọc ELISA
(Theo bộ kit SERELISA®Rabies Ab Mono Indirect)
49
Nguyên lý phản ứng
Kit SERELISA®Rabies Ab Mono Indirect cho phép định lượng kháng thể bệnh dại trong mẫu huyết thanh của từng cá thể động vật. Hàm lượng kháng thể tối thiểu 0,6 IU/ml là cĩ thể bảo hộ chống bệnh dại (WHO, 1992). Phản ứng bao gồm 3 bước:
- Cho mẫu huyết thanh vào giếng đã gắn kháng nguyên virus dại vơ hoạt. Kháng thể hiện diện trong mẫu kết hợp với kháng nguyên virus phủ ở đáy giếng.
- Sau khi rửa, thêm protein A - conjugate vào để kết hợp với kháng thể bắt giữ trước đĩ, hình thành phức hợp (Rabies Ag) - (Ab anti-Rabies) - (Protein A/peroxidase).
- Tiếp tục rửa để loại bỏ conjugate thừa, Enzyme gắn với phức hợp được phát hiện bằng cách thêm chất nền, làm sản phẩm cĩ màu. Sau khi ngừng phản ứng, đo mật độ quang học. Sự hiện diện hay vắng mặt của kháng thể được xác định bằng giá trị của ngưỡng thu được từ đối chứng dương.
c. Quy trình thực hiện phản ứng
Cơng tác chuẩn bị: thực hiện cẩn thận việc phân bổ mẫu nhằm dễ dàng nhận diện và phân biệt mẫu đối chứng và mẫu xét nghiệm. Các nội dung cần thực hiện:
(1) Chuẩn bị mẫu huyết thanh: Pha lỗng mẫu với chất pha lỗng mẫu (SD) như sau: mẫu được pha lỗng lần 1 ở 1/10 trong đĩa trống (10µl mẫu pha với 90µl SD).
(2) Chuẩn độ huyết thanh, 07 độ pha lỗng huyết thanh chuẩn (WHO,1992) được tiến hành ngay trên ống hay đĩa với độ pha lỗng 1/10; 1/30; 1/100; 1/150; 1/300; 1/1.000 và 1/3.000 theo như Bảng 3.3.
Bảng 3.3: Dãy pha lỗng huyết thanh chuẩn trong phản ứng ELISA (WHO, 1992) Tỷ lệ pha lỗng 1/10 1/30 1/100 1/150 1/300 1/1.000 1/3.000 Chú thích: SD là chất pha lỗng mẫu 50
Thực hiện phản ứng gồm các các bước như sau:
(1) Phân bổ đối chứng và mẫu xét nghiệm
- Phân bổ đối chứng: đối chứng khơng cĩ sẵn và nên được pha lỗng 1/10; sau đĩ lấy 90µl chất pha lỗng mẫu +10 µl đối chứng âm của kit cho vào giếng A1 & A2; 10 µl đối chứng dương của kit cho vào giếng B1 & B2.
- Phân bổ mẫu và pha lỗng huyết thanh theo chuẩn của WHO (Bảng 3.4): lấy 90µl chất pha lỗng mẫu cùng với 10µl mẫu tiền pha lỗng 1/10 hay huyết thanh chuẩn, pha lỗng từ 1/10 đến 1/3.000 trong giếng test và trộn đều. Chú ý luơn đặt strip theo thứ tự sao cho sử dụng được cả hai máy rửa và máy đọc. Sau đĩ, phủ lên giếng tấm film với chiều dài tấm film vừa vặn với giếng đã dùng và trộn đều bằng cách lắc nhẹ bằng máy lắc. Bảng 3.4: Định lượng kháng thể (pha lỗng cuối cùng) trong phản ứng ELISA
A B C D E F G H
Chú thích: N: đối chứng âm; P: đối chứng dương
Giá trị OD cĩ thể thấy ở pha lỗng WHO 1/100. Trường hợp này, dùng tiếp 06 mức pha lỗng tiếp theo để vẽ đường cong hồi qui.
(2) Ủ đĩa trong 1 giờ ±5 phút ở nhiệt độ 37±3oC.
(3) Rửa nguyên liệu, pha lỗng dung dịch rửa thành 1/10 với nước cất hay nước khử khống; Di chuyển tấm film cẩn thận và rửa 04 lần.
(4) Conjugate: đầu tiên cần chuẩn bị conjugate bằng cách pha lỗng conjugate 1/10 chất pha lỗng conjugate. Chú ý hàm lượng phải là 2ml/strip; cĩ nghĩa là 200µl/1,8 ml CD. Sau đĩ, thêm 100 µl conjugate pha lỗng vào tất cả các giếng và phủ tấm film mới.
(5) Ủ conjugate trong 01 giờ ±5 phút ở 37±3oC.
51
(6) Rửa: di chuyển tấm film cẩn thận và rửa 04 lần; Thêm 100µl chất nền peroxidase PS vào mỗi giếng. Khơng phủ film giai đoạn này. Trộn đều dung dịch bằng cách dùng máy lắc thủ cơng.
(7) Ủ chất nền: Ủ 30±5 phút; ở nhiệt độ phịng (20±5oC), tránh ánh sáng.
(8) Thêm 50 µl dung dịch ngừng phản ứng (S) vào giếng. Trộn đều dung dịch bằng cách dùng máy lắc thủ cơng hay máy trộn để đảm bảo khơng cĩ bọt trong giếng.
(9) Đo mật độ quang học (OD) bằng biochromaticallly ở 450 và 630 nm (trong dải màu vàng). Nếu đọc bằng monochromatic, phải đảm bảo sạch đáy giếng trước khi đọc.
(10) Đọc kết quả
Đánh giá kết quả của giá trị test: Khi OD đối chứng dương ≥0,300; Khi OD đối chứng âm <0,50 x OP P và khi hệ số tương quan giữa ln ODs và nồng độ kháng thể bệnh dại đối với huyết thanh chuẩn WHO > 0,95.
Biểu diễn và giải thích kết quả: Dùng đường cong hồi qui để tính chuẩn độ; Tính giá trị OD trung bình của mỗi mẫu test và của mỗi pha lỗng huyết thanh WHO. Tính giá trị ln của mỗi OD trung bình và giá trị ln của nồng độ kháng thể bệnh dại cho mỗi pha lỗng WHO (từ 6,7 đến 0,0223IU/ml, mà khơng thuyết phục tính tốn 1/100 yếu tố pha lỗng test. Biễu diễn kết quả bằng biểu đồ ln (OD) (Y-axis) như chức năng của ln (nồng độ kháng thể bệnh dại) (X-axis) dựa vào Bảng vẽ đường cong tham chiếu so với huyết thanh chuẩn WHO (Hình 3.7).
Hình 3.8: Đường cong tham chiếu của huyết thanh chuẩn WHO
Dùng tất cả kết quả thu được đối với pha lỗng huyết thanh chuẩn WHO, thực hiện một đường cong hồi qui giữa nồng độ kháng thể bệnh dại (biểu diễn EU/ml, tương đương đơn vị/ml); và ln OD, thành lập mơ hình tốn học tương ứng: ln (nồng độ kháng thể bệnh dại (IU/ml) = a + b * ln OD
52
Mỗi mẫu test, tính giá trị OD trung bình và nồng độ kháng thể bệnh dại của mẫu được xác định bằng cơng thức: Nồng độ kháng thể bệnh dại mẫu (IU/ml) = e(a+b* ln OD). Nếu chuẩn độ >0,6 thì thú được xem như đã được bảo hộ (+) hoặc chuẩn độ <0,6 thì xem như thú khơng được bảo hộ (-).
3.4.4 Phương pháp khảo sát đáp ứng miễn dịch trên chĩ sau khi tiêm vaccine dại Rabisin và miễn dịch thụ động của chĩ con
Đánh giá đáp ứng miễn dịch trên chĩ sau tiêm phịng vaccine dại (Rabisin) tại Kiên Giang và miễn dịch thụ động của chĩ con qua xét nghiệm huyết thanh học bằng phản ứng ELISA gián tiếp với số mẫu được tính tối thiểu theo cơng thức của Thrusfield (2005) như sau:
= 2
(1− /2)
Trong đĩ:
n: Cỡ mẫu yêu cầu
Z: Giá trị phân phối chuẩn (Z=1,96) với độ tin cậy (1-α/2 =95%)
P: Tỷ lệ dương tính dự đốn (60%) d: Độ tin cậy thiết kế (d=10%)
Theo cơng thức trên thì số lượng mẫu cần lấy là: N = [(1,96)2 x 0,6 (1- 0,6)]/0,12 = 92
Như vậy, số lượng mẫu cần lấy là 92. Nhưng số lượng mẫu huyết thanh chĩ thực tế lấy để xét nghiệm là 153. Kiên Giang là một tỉnh cĩ địa hình rất đa dạng, vừa cĩ đồng bằng vừa cĩ đồi núi và biển đảo. Tổng đàn chĩ tỉnh Kiên Giang đứng thứ hai ở vùng ĐBSCL và tỷ lệ tiêm phịng dại trên trên chĩ cịn ở mức thấp (8,34%) - Chi cục Thú y vùng VII năm 2015-2016), là một trong 3 tỉnh của vùng ĐBSCL (Kiên Giang, Đồng Tháp và Trà Vinh) cĩ nguy cơ bệnh dại trung bình của cả nước. Dựa vào các đặc điểm dịch tễ về