Các chất màu được sử dụng đầu tiên để đo đạc FCS là các chất phát huỳnh quang đã được biết đến trong đo đạc phổ huỳnh quang và kính hiển vi (ví dụ, fluorescein) và các chất màu laze. Tuy vậy, trong các kỹ thuật đo đạc đạt mức độ đơn phân tử như FCS, yêu cầu đặt ra cho các chất phát huỳnh quang không chỉ là có hiệu suất lượng tử cao và tiết diện hấp thụ lớn như trong các phương pháp quang phổ truyền thống. Đặc tính quan trọng nhất là tính bền quang. Chất màu phải đủ bền để chịu được năng lượng rất cao tại điểm hội tụ laze (có thể lên tới 100 kW/cm2) [89, 90].
Đối với các ứng dụng đơn phân tử như FCS, hiện nay người ta thường dùng các chất màu được thiết kế riêng như Alexa 488 (Molecular Probes) với đặc tính hấp thụ và phát xạ tương tự và có độ bền quang cao hơn. Họ chất màu Alexa cho sự lựa chọn phong phú với nhiều màu khác nhau. Cực đại hấp thụ nằm trong khoảng từ 350- 750 nm, bao gồm vùng quang phổ nhìn thấy. Các chất màu khác thích hợp là các Rođamin như Rođamin xanh, Tetrametyl rođamin, Rođamin B và Rođamin 6G và các xyanua (Cy2, Cy3, Cy5) [89]. Hình 1.10 trình bày công thức hoá học của một số chất màu thường sử dụng trong đo đạc FCS.
Chấm lượng tử bán dẫn cũng là đối tượng phát quang được sử dụng rộng rãi trong đo đạc FCS. Vật liệu này có thể thay thế chất màu [91] do tính bền quang đặc biệt, có phổ phát xạ đối xứng, hẹp, phụ thuộc chủ yếu vào kích thước và thành phần của hạt [92]. FCS ứng dụng cho chấm lượng tử được trình bày cụ thể trong phần 1.3. FCS cũng được ứng dụng rộng rãi cho các hạt nano silica mang tâm màu để nghiên cứu tương tác của hạt với các phân tử sinh học [93-100]. Gần đây, FCS đã được ứng dụng để đánh giá cacbon nanodot (CND) là một loại vật liệu mới trên cơ sở cacbon với những đặc tính phát quang riêng biệt. Phổ huỳnh quang của loại vật liệu này phụ thuộc vào bước sóng kích thích. Phương pháp thông dụng tổng hợp CND theo hướng “từ dưới đi lên” (bottom-up) xuất phát từ các phân tử hữu cơ như L- ascobic acid, -alanine, folic acid, glucose, v.v. … [49, 101]. Tuy vậy, nguồn gốc phát quang của CND vẫn còn chưa được làm sáng tỏ. Kích thước hạt của CND thường được xác định qua ảnh TEM. Gần đây, một số tác giả [49] đã đưa ra ý kiến rằng các hạt quan sát được trên ảnh TEM là kết quả của sự kết tinh của các phân tử chất màu như methylensuccinic axit trên đế mẫu. Tính chất quang của mẫu thực tế xuất phát từ
các chất màu hình thành trong quá trình tổng hợp và tồn tại trong dung dịch ở dạng phân tử. Các đám kết tụ (aggregate) của phân tử chất màu thể hiện như các hạt trên ảnh TEM, gây nhầm lẫn với CND. Do đó, ảnh TEM không phản ánh đặc điểm của mẫu trong dung dịch. Nếu chỉ dựa vào ảnh TEM có thể dẫn đến lý giải không chính xác về tính chất quang và mối liên hệ với kích thước vật lý của mẫu. Để giải quyết vấn đề này, FCS với ưu thế đo đạc kích thước hạt trong dung dịch đã được đề xuất sử dụng nhằm nghiên cứu CND tổng hợp từ axit xitric [49].
Alexa 488 Cy5
Rođamin B Rođamin 6G
Hình 1.10. Một số chất màu thường sử dụng trong đo đạc FCS.
Do có sự phụ thuộc của hàm tương quan vào tốc độ khuếch tán, FCS là phương pháp giá trị để đo đạc các tương tác liên kết như quá trình đóng cặp của các ADN, và xác định kích thước của hạt nano phát quang.