1.2.1. Nguyên lý đo và các phương trình lý thuyết FCS
Phổ tương quan huỳnh quang – FCS (Fluorescence correlation spectroscopy) dựa trên phân tích thống kê sự thăng giáng của cường độ huỳnh quang theo thời gian [80-83]. FCS được tiến hành với các phần tử phát huỳnh quang khuếch tán tự do. Đây
là phương pháp dựa trên tín hiệu của từng phân tử hoặc một số ít các phân tử. Thăng giáng tín hiệu huỳnh quang tối ưu khi chỉ có một vài phân tử trong thể tích đo.
Khi một phần tử phát quang khuếch tán vào trong một chùm ánh sáng hội tụ, sẽ có một đám (burst) các photon phát xạ do có nhiều vòng lặp kích thích – phát xạ từ cùng một phần tử phát quang (hình 1.9). Phần tử phát quang kích thước nhỏ khuếch tán nhanh ra khỏi thể tích, do đó, đám photon sẽ ngắn. Nếu phần tử phát quang khuếch tán chậm hơn (kích thước lớn, hoặc độ nhớt cao), đám photon sẽ kéo dài.
Tốc độ khuếch tán tại một nhiệt độ nhất định phụ thuộc vào kích thước của phần tử phát quang và độ nhớt của môi trường. Hệ số khuếch tán DT và bán kính động lực học của hạt Rh có mối liên hệ theo phương trình Stokes-Einstein:
𝐷 = 𝑘𝑇
6𝜋𝜂𝑅 (1.11)
Quá trình khuếch tán của phần tử phát quang gây ra sự thăng giáng của cường độ huỳnh quang F(t) trong một thể tích rất nhỏ. Sự thăng giáng của tín hiệu huỳnh quang F(t) được định nghĩa là sự sai lệch khỏi giá trị trung bình theo thời gian của cường độ tín hiệu 〈𝐹(𝑡)〉[80, 83-85]:
𝛿𝐹(𝑡) = 𝐹(𝑡) − 〈𝐹(𝑡)〉
với 〈𝐹(𝑡)〉 = ∫ 𝐹(𝑡)𝑑𝑡 (1.12)
Hình 1.9. Tính toán đường tương quan huỳnh quang từ cường độ huỳnh quang phụ thuộc thời gian [80].
Hàm tương quan thực nghiệm G() chuẩn hóa được định nghĩa như sau [80, 83-86]:
𝐺(𝜏) =〈𝛿𝐹(𝑡) ∙ 𝛿𝐹(𝑡 + 𝜏)〉
〈𝐹(𝑡)〉 =
〈𝐹(𝑡) ∙ 𝐹(𝑡 + 𝜏)〉
〈𝐹(𝑡)〉 − 1 (1.13)
Đối với một loại hạt khuếch tán tự do theo ba chiều không gian, với tính chất huỳnh quang không thay đổi theo thời gian quan sát, hàm tương quan G() được biểu diễn theo phương trình lý thuyết sau [80, 83, 86-88]:
𝐺(𝜏) = 1 𝑉eff 〈𝐶〉∙ 1 1 + ∙ 1 1 + ∙ = 1 𝑁∙ 1 1 + ∙ 1 1 + ∙ (1.14) là thời gian trễ,
D được gọi là thời gian khuếch tán của phân tử/hạt, là thời gian suy giảm đặc trưng của hàm tương quan G(). Tại giá trị = D, G ½ G(0).
N là số hạt trung bình trong thể tích đo,
= r0 /z0 với r0 và z0 là các thông số của thể tích đo. Ánh sáng kích thích trong thể tích đo có phân bố không gian ba chiều dạng hàm Gauss. Tại vị trí r = r0
theo phương bán kính và tại z = z0 theo phương trục, cường độ kích thích suy giảm còn 1/e.
C là nồng độ trung bình của phần tử phát quang,
Veff là thể tích đo hiệu dụng,
𝑉eff = 𝜋 ∙ 𝑟 ∙ 𝑧 (1.15)
D, N và tìm được bằng cách so sánh bình phương tối thiểu phi tuyến các hàm tương quan G() thực nghiệm và lý thuyết. Kích thước r0 và z0 thường được xác định từ đo đạc FCS với phân tử phát quang đã biết hệ số khuếch tán.
Giữa D và hệ số khuếch tán DT (giá trị của DT phụ thuộc nhiệt độ T, không phụ thuộc vào cấu hình của hệ đo) có mối liên hệ:
𝜏 = 𝑟
4 ∙ 𝐷 (1.17)
trong đó T là nhiệt độ Kelvin, k là hằng số Boltzmann, là độ nhớt của môi trường. Như vậy, từ giá trị của D trong hàm tương quan G() có thể tìm được hệ số khuếch tán DT và từ đó tính được bán kính thủy động lực học Rh của hạt.
1.2.2. Các đối tượng phát quang trong đo đạc FCS
Các chất màu được sử dụng đầu tiên để đo đạc FCS là các chất phát huỳnh quang đã được biết đến trong đo đạc phổ huỳnh quang và kính hiển vi (ví dụ, fluorescein) và các chất màu laze. Tuy vậy, trong các kỹ thuật đo đạc đạt mức độ đơn phân tử như FCS, yêu cầu đặt ra cho các chất phát huỳnh quang không chỉ là có hiệu suất lượng tử cao và tiết diện hấp thụ lớn như trong các phương pháp quang phổ truyền thống. Đặc tính quan trọng nhất là tính bền quang. Chất màu phải đủ bền để chịu được năng lượng rất cao tại điểm hội tụ laze (có thể lên tới 100 kW/cm2) [89, 90].
Đối với các ứng dụng đơn phân tử như FCS, hiện nay người ta thường dùng các chất màu được thiết kế riêng như Alexa 488 (Molecular Probes) với đặc tính hấp thụ và phát xạ tương tự và có độ bền quang cao hơn. Họ chất màu Alexa cho sự lựa chọn phong phú với nhiều màu khác nhau. Cực đại hấp thụ nằm trong khoảng từ 350- 750 nm, bao gồm vùng quang phổ nhìn thấy. Các chất màu khác thích hợp là các Rođamin như Rođamin xanh, Tetrametyl rođamin, Rođamin B và Rođamin 6G và các xyanua (Cy2, Cy3, Cy5) [89]. Hình 1.10 trình bày công thức hoá học của một số chất màu thường sử dụng trong đo đạc FCS.
Chấm lượng tử bán dẫn cũng là đối tượng phát quang được sử dụng rộng rãi trong đo đạc FCS. Vật liệu này có thể thay thế chất màu [91] do tính bền quang đặc biệt, có phổ phát xạ đối xứng, hẹp, phụ thuộc chủ yếu vào kích thước và thành phần của hạt [92]. FCS ứng dụng cho chấm lượng tử được trình bày cụ thể trong phần 1.3. FCS cũng được ứng dụng rộng rãi cho các hạt nano silica mang tâm màu để nghiên cứu tương tác của hạt với các phân tử sinh học [93-100]. Gần đây, FCS đã được ứng dụng để đánh giá cacbon nanodot (CND) là một loại vật liệu mới trên cơ sở cacbon với những đặc tính phát quang riêng biệt. Phổ huỳnh quang của loại vật liệu này phụ thuộc vào bước sóng kích thích. Phương pháp thông dụng tổng hợp CND theo hướng “từ dưới đi lên” (bottom-up) xuất phát từ các phân tử hữu cơ như L-ascobic acid, -alanine, folic acid, glucose, v.v. … [49, 101]. Tuy vậy, nguồn gốc phát quang của CND vẫn còn chưa được làm sáng tỏ. Kích thước hạt của CND thường được xác định qua ảnh TEM. Gần đây, một số tác giả [49] đã đưa ra ý kiến rằng các hạt quan sát được trên ảnh TEM là kết quả của sự kết tinh của các phân tử chất màu như methylensuccinic axit trên đế mẫu. Tính chất quang của mẫu thực tế xuất phát từ
các chất màu hình thành trong quá trình tổng hợp và tồn tại trong dung dịch ở dạng phân tử. Các đám kết tụ (aggregate) của phân tử chất màu thể hiện như các hạt trên ảnh TEM, gây nhầm lẫn với CND. Do đó, ảnh TEM không phản ánh đặc điểm của mẫu trong dung dịch. Nếu chỉ dựa vào ảnh TEM có thể dẫn đến lý giải không chính xác về tính chất quang và mối liên hệ với kích thước vật lý của mẫu. Để giải quyết vấn đề này, FCS với ưu thế đo đạc kích thước hạt trong dung dịch đã được đề xuất sử dụng nhằm nghiên cứu CND tổng hợp từ axit xitric [49].
Alexa 488 Cy5
Rođamin B Rođamin 6G
Hình 1.10. Một số chất màu thường sử dụng trong đo đạc FCS.
Do có sự phụ thuộc của hàm tương quan vào tốc độ khuếch tán, FCS là phương pháp giá trị để đo đạc các tương tác liên kết như quá trình đóng cặp của các ADN, và xác định kích thước của hạt nano phát quang.
1.2.3. Cấu hình của hệ đo FCS
Đo đạc FCS cần đáp ứng các yêu cầu sau:
Thể tích đo cần giảm xuống cỡ femto-lít [80, 84],
Nguồn laze ổn định cường độ,
Đầu thu có độ nhạy lớn,
Đối tượng đo là các chất phát quang cần có hiệu suất lượng tử cao. Các yêu cầu này được đáp ứng bằng cấu hình của hệ đo với các đặc điểm sau [81]:
Laze ổn định,
Các đầu thu có hiệu suất cao, nhiễu thấp.
Nguồn laze kích thích phát bước sóng đơn sắc được lựa chọn tùy thuộc vào phần tử mang màu cần đo đạc. Hệ đo FCS phổ biến sử dụng kích thích đơn photon. Thường dùng các laze đơn sắc với bước sóng nằm trong vùng khả kiến (400-700 nm) [102, 103] như laze Ar (bước sóng 488 nm) hoặc laze Ar-Kr (cho phép lựa chọn bước sóng kích thích), hoặc dùng các laze giá thành thấp hơn như He-Ne đơn vạch (bước sóng 514 nm và 633 nm) hay laze diode với nhiều bước sóng khác nhau. Công suất phát của các laze này cần phải rất ổn định theo thời gian.
Hệ đo cần đạt độ phân giải không gian cao theo cả ba chiều không gian để tạo ra thể tích đo cỡ femto-lít. Đối với trường hợp kích thích đơn photon, thường có hiện tượng kích thích xảy ra trong một vùng không gian tương đối lớn, các phần tử ở ngoài thể tích hội tụ của ánh sáng kích thích cũng phát quang. Để có giảm chiều z của thể tích đo xuống cỡ m, cần có cấu hình quang học đồng tiêu trong phần thu tín hiệu. Cấu hình đồng tiêu sử dụng một pinhole kích thước trong khoảng 20-100 m đặt trong mặt phẳng ảnh để chặn tín hiệu huỳnh quang không xuất phát từ thể tích hội tụ của laze, nhờ đó thu hẹp vùng không gian đo đạc theo phương trục. Kích thước của thể tích đo theo phương ngang xy có thể giảm tới mức giới hạn nhiễu xạ (khoảng 250 nm) bằng cách sử dụng vật kính hiển vi với khẩu độ số NA cao (lý tưởng là NA > 0,9) [84, 103].
Hình 1.11 trình bày cấu hình hệ FCS điển hình sử dụng các kính hiển vi thương mại [82]. Chùm tia laze kích thích được dẫn đến vật kính hiển vi với khẩu độ số cao và hội tụ vào mẫu. Ánh sáng huỳnh quang từ mẫu được thu lại với cùng vật kính, cho đi qua gương lưỡng chiết và phin lọc phát xạ. Trong phần thu tín hiệu, một pinhole được đặt tại điểm hội tụ chùm sáng huỳnh quang cho ta độ phân giải theo trục z. Sau đó, ánh sáng huỳnh quang được hội tụ vào đầu thu.
Các đầu thu thông dụng là ống nhân quang điện (photomultiplier tube – PMT) hoặc photodiode thác lũ (avalanche photodiode – APD) với độ nhạy đơn photon và có nhiễu thấp. Tuy vậy, cấu hình hệ FCS với một đầu thu thường cho đường tương quan bị ảnh hưởng của nhiễu từ đầu thu (ví dụ hiện tượng xung phụ (nhiễu) đi kèm xung photon chính – afterpulsing của APD). Để giảm ảnh hưởng của nhiễu, tín hiệu huỳnh quang có thể được chia đôi đưa vào hai đầu thu giống nhau [89] và tính đường tương quang chéo của tín hiệu.
Đường tương quan thực nghiệm G() được tính toán nhờ một card tương quan hoặc sử dụng phần mềm chuyên dụng. Phân tích số liệu dựa trên so sánh với hàm lý thuyết trên cơ sở bình phương tối thiểu Marquant – Levenberg [103].
1.2.4. Phương pháp FCS xác định tương tác phân tử
Khi phản ứng xảy ra ở thang thời gian lớn hơn nhiều so với khoảng thời gian ngắn mà các phân tử nằm trong thể tích đo đạc, có thể dùng phương pháp FCS để khảo sát. Các phản ứng như vậy có thể được theo dõi bằng cách đo FCS liên tục [89] (hình 1.12). Các đường tương quan liên tiếp được khảo sát với thời gian ngắn nhất có thể. Từ các đường này, tìm hiểu sự thay đối của các thông số như thời gian khuếch tán, độ sáng phân tử hoặc nồng độ. Một hệ phản ứng lý tưởng gồm một phân tử nhỏ, được đánh dấu và một phân tử không phát quang. Đơn giản nhất là trường hợp chỉ có một loại chất phát huỳnh quang (hoàn toàn tự do hoặc liên kết 100%) tồn tại ở thời điểm bắt đầu và kết thúc của quá trình kết hợp.
Nguyên lý này được sử dụng để theo dõi động học liên kết của các đầu dò DNA phát quang với một DNA đích [104], động học quá trình lai hóa của các đầu dò DNA có các vị trí liên kết khác nhau [105], nghiên cứu nhiều hệ phối tử-chất nhận (ligand-receptor) [106-108].
Hình 1.12. Sự thay đổi thời gian khuếch tán của một phối tử nhỏ khi liên kết với một protein nặng hơn [89].
Phương pháp FCS phù hợp để nghiên cứu các quá trình tương tác của các phân tử hoặc hạt nano trong tế bào với yêu cầu quan sát trong thể tích rất nhỏ. Sự linh động của phân tử thay đổi mạnh khi có liên kết với màng tế bào. Khi một phân tử liên kết với màng hoặc với các protein màng có vai trò các chất nhận, phương pháp FCS cho thấy cả kiểu khuếch tán (hai chiều thay cho ba chiều) và thang thời gian đặc trưng đều thay đổi [109, 110].
1.2.5. Hiệu ứng chống bó (antibunching) của đơn phân tử và đơn hạt phát quang Để đặc trưng các đơn phân tử chất màu và đơn hạt phát quang, yêu cầu đầu Để đặc trưng các đơn phân tử chất màu và đơn hạt phát quang, yêu cầu đầu tiên là tín hiệu thu được phải thực sự từ một phân tử hoặc hạt riêng lẻ. Minh chứng cho đo đạc đơn phân tử/đơn hạt là hiệu ứng chống bó (antibunching).
Đối với một hệ lượng tử cô lập, một photon được phát ra khi hệ lượng tử chuyển dời giữa hai mức năng lượng riêng biệt. Do vậy về cơ bản các nguồn bức xạ này là các nguồn sáng phát ra đơn photon. Hiệu ứng chống bó của các photon có thể được hiểu một cách hình tượng là bắt nguồn từ các hệ lượng tử riêng rẽ và cô lập (ví dụ như đơn phân tử hoặc đơn hạt nano) thực hiện các chu kỳ kích thích – bức xạ và hệ chỉ có thể phát ra duy nhất một photon tại một thời điểm. Để đặc trưng cho trường bức xạ phát ra từ những nguồn sáng này người ta thường sử dụng hàm tương quan bậc 2 của trường bức xạ thông qua việc xác định bằng thực nghiệm hiệu ứng chống bó của photon theo cấu hình HBT (Hanbury-Brown-Twiss) [111-116]. Đối với
photon huỳnh quang phát xạ từ các đơn phân tử hoặc đơn nguyên tử, hàm tương quan G() đo được với cấu hình HBT có dạng:
𝐺(𝜏) = 1 − 1
𝑁𝑒 (1.18)
với F là thời gian sống huỳnh quang.
Đối với một hệ lượng tử với thời gian sống hữu hạn nào đó ở trạng thái kích thích, hàm tương quan G() sẽ giảm từ giá trị 1 về giá trị cực tiểu lý tưởng là bằng 0 trong khoảng thời gian tương đương thời gian sống của hệ [111, 117]. Đặc tính chống bó có thể xem là bằng chứng thực nghiệm để phát hiện được các nguồn bức xạ đơn photon, tức là bức xạ phát ra từ đơn hạt nano hoặc đơn phân tử. Khi nguồn sáng là tổ hợp của nhiều nguồn phát đơn photon thì hiệu ứng chống bó dễ dàng mất đi do sự chồng chập về mặt thống kê. Do đó trong thực tế việc đo đạc hiệu ứng chống bó là rất khó khăn và thường cần các thiết bị có độ nhạy và độ phân giải thời gian cao cùng với việc chuẩn bị mẫu đo thật cẩn thận. Hiệu ứng chống bó hoàn toàn có thể đo đạc trên hệ đo FCS với đầu thu và mô-đun ghi nhận tín hiệu có độ phân giải thời gian cao.
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Kỹ thuật đo phổ tương quan thăng giáng dựa trên tín hiệu huỳnh quang FCS có ứng dụng tương đối đa dạng, trong đó ứng dụng để đo đạc tính chất và kích thước thủy động lực học của các hệ nano đã được phát triển trong thời gian gần đây. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng đo đạc kích thước bằng FCS có nhiều ưu điểm so với các phương pháp đo TEM, tán xạ tia X - XRD hoặc DLS [118]. XRD hay TEM yêu cầu làm khô mẫu trong chân không, trong khi phép đo FCS thực hiện trực tiếp trong dung dịch, tránh được sự thay đổi xảy ra khi mẫu được làm khô. Lượng mẫu cần dùng tương đối ít so với DLS (thể tích đo khoảng femto-lít nên lượng mẫu cần dùng chỉ khoảng vài chục micro-lít, nồng độ mẫu đo thấp hơn 10-7 M) [119]. Đo đạc với FCS có lợi thế trong nghiên cứu sự tương quan giữa kích thước và tính chất phát huỳnh quang của hạt vì sử dụng tín hiệu huỳnh quang từ hạt, trong khi TEM hoặc DLS đo kích thước của tất cả các hạt có trong mẫu. Trong các điều kiện nhất định, FCS có thể đo đạc in-situ sự thay đổi của hạt nano trong dung dịch chứa các phân tử sinh học