1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Kỹ thuật đo phổ tương quan thăng giáng dựa trên tín hiệu huỳnh quang FCS có ứng dụng tương đối đa dạng, trong đó ứng dụng để đo đạc tính chất và kích thước thủy động lực học của các hệ nano đã được phát triển trong thời gian gần đây. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng đo đạc kích thước bằng FCS có nhiều ưu điểm so với các phương pháp đo TEM, tán xạ tia X - XRD hoặc DLS [118]. XRD hay TEM yêu cầu làm khô mẫu trong chân không, trong khi phép đo FCS thực hiện trực tiếp trong dung dịch, tránh được sự thay đổi xảy ra khi mẫu được làm khô. Lượng mẫu cần dùng tương đối ít so với DLS (thể tích đo khoảng femto-lít nên lượng mẫu cần dùng chỉ khoảng vài chục micro-lít, nồng độ mẫu đo thấp hơn 10-7 M) [119]. Đo đạc với FCS có lợi thế trong nghiên cứu sự tương quan giữa kích thước và tính chất phát huỳnh quang của hạt vì sử dụng tín hiệu huỳnh quang từ hạt, trong khi TEM hoặc DLS đo kích thước của tất cả các hạt có trong mẫu. Trong các điều kiện nhất định, FCS có thể đo đạc in-situ sự thay đổi của hạt nano trong dung dịch chứa các phân tử sinh học [120]. Nghiên cứu hạt nano sử dụng phương pháp FCS bao gồm:
+ Đặc trưng tính chất động lực học của các chấm lượng tử [70, 102, 121-125], các tinh thể nano dạng cầu [126], nano dạng que [127] và các hạt nano polyme phát quang [128]. Xác định kích thước bằng FCS dựa trên cơ sở mô hình khuếch tán tự do truyền thống và dựa trên so sánh giữa thời gian khuếch tán của hạt nano và của một chất màu đã biết hệ số khuếch tán khi đi qua một thể tích hội tụ đồng tiêu [70, 128- 133].
Phương pháp FCS đã được ứng dụng để khảo sát đường kính thủy động lực học của các chấm lượng tử có cấu trúc lõi/vỏ vô cơ và các chấm lượng tử đơn lõi CdTe với lớp vỏ bọc hữu cơ là mecaptopropyl ancol hoặc glutathione (GSH) [70, 134, 135]. So sánh kích thước theo FCS và theo TEM đưa đến các kết luận: 1. Ảnh hưởng của các phối tử mạch ngắn đến kích thước thủy động lực học là tương đối nhỏ [130]; 2. Chấm lượng tử cấu trúc lõi/vỏ có lớp bọc hữu cơ mỏng hơn so với loại đơn lõi, cho thấy hóa học bề mặt khác nhau trong hai trường hợp [70]. Khảo sát bằng FCS cho thấy các chấm lượng tử CdTe có kích thước lõi giống nhau (thể hiện ở phổ hấp thụ exciton và phổ phát xạ tương tự nhau) nhưng các phối tử bề mặt khác nhau (bao gồm axit mecaptoaxetic, axit 3-mecaptopropionic (MPA), axit mecaptosuccinic (MSA) và N-acetyl-L-cysteine) có thời gian khuếch tán khác nhau [129]. Kết quả này thể hiện độ dày của lớp bọc hữu cơ phụ thuộc vào phối tử bề mặt.
+ Nghiên cứu quá trình nhấp nháy của chấm lượng tử: Quá trình nhấp nháy của chấm lượng tử tự do trong dung dịch được khảo sát bằng cách kết hợp FCS với các phương pháp quang phổ đo đạc trong thể tích khối. Đặc tính của quá trình nhấp nháy của chấm lượng tử được kết luận là bị ảnh hưởng bởi tính lập thể của phối tử liên kết với bề mặt [136]. Oura và cộng sự dùng FCS để chứng minh rằng nhấp nháy và hiệu ứng chống bó huỳnh quang của chấm lượng tử hoặc thanh lượng tử có thể thay đổi theo giá trị pH của dung dịch [137]. Song song với việc sử dụng kết quả đo đạc FCS cho các chấm lượng tử để nghiên cứu hiện tượng nhấp nháy, một số nghiên cứu tìm cách loại trừ ảnh hưởng của hiện tượng này đến kết quả đo đạc FCS bằng cách sử dụng cường độ laze kích thích thấp. Một cách tiếp cận gần đây do Thomaz và các cộng sự (Brazil) đề xuất [132] sử dụng đường biểu diễn phụ thuộc của thời gian khuếch tán vào cường độ laze, dùng phương pháp ngoại suy để tìm thời gian khuếch tán tại cường độ laze = 0.
+ Khảo sát sự liên hợp của hạt nano với các phân tử chất màu hoặc phân tử sinh học trong dung dịch: Hấp phụ của các phân tử chất màu phát quang Rođamin 6G ở các nồng độ rất thấp (2 x 10-9 đến 2 x 10-7 M) trên các hạt oxit kích thước nano tích điện âm được khảo sát [138] mà không cần phân tách các phần tử hấp phụ và không hấp phụ trong mẫu. Kết quả phù hợp với mô hình hấp phụ Langmuir. Các kết quả này cho thấy hiệu quả của phương pháp đo đạc FCS trong việc khảo sát cân bằng hấp phụ tại bề mặt phân cách lỏng – rắn. Liên kết của chấm lượng tử với các phân tử sinh học, như annexin V [139], albumin huyết thanh bò (BSA) [140], kháng sinh [141], v.v…. đã được chứng minh nhờ đo FCS. Định lượng sự hấp phụ của horseradish peroxidase trên bề mặt của chấm lượng tử [142], hoặc của albumin huyết thanh người (human serum albumin - HSA) trên các hạt CdSe/ZnS [143] được thực hiện bằng phương pháp FCS. Các tác giả đã kết luận chỉ một phân tử horseradish peroxidase hấp phụ trên bề mặt chấm lượng tử, độ dày của đơn lớp HSA hình thành trên hạt nano là 3,3 nm. Ảnh hưởng bởi nồng độ muối, nhiệt độ và pH đến sự kết hợp của chấm lượng tử và BSA [140, 143], sự thay đổi của các chấm lượng tử CdSe và CdSe/ZnS trong các dung dịch actin phức tạp cũng được khảo sát bằng phương pháp FCS [144].
+ Khảo sát các quá trình khuếch tán của hạt nano trong tế bào: Phương pháp FCS quan sát tín hiệu huỳnh quang ở mức độ đơn hạt/đơn phân tử, vì vậy thích hợp để khảo sát động lực học khuếch tán của chấm lượng tử tại các vùng nội tế bào và vị trí của hạt trong tế bào. Các kết quả cho thấy có mối liên quan rõ ràng giữa khả năng thâm nhập tế bào của hạt và đường kính thủy động lực học [129].
FCS là một phương pháp phát hiện dựa trên tín hiệu từ đơn hạt/đơn phân tử nên có độ nhạy cao, có tiềm năng ứng dụng lớn trong phân tích đồng thể [118]. Hiện nay, các thiết bị đo FCS thương mại được nhiều công ty phát triển và được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng, ví dụ, loạt thiết bị ConfoCor các đời khác nhau của Carl Zeiss, FCS2 của Leica, hệ FCS của ISS Alba, MF20 của Olympus, C9413-FCS của Hamamatsu, Micro Time 200 của PicoQuant, v.v… Các hệ thương mại này thường có giá thành cao vì được thiết kế đi kèm với chức năng hiện ảnh. Do đó, xây dựng một hệ FCS đơn giản dùng cho các phép phân tích đồng thể là giải pháp phù hợp hơn và có hiệu quả kinh tế cao hơn.
Trên cơ sở của phương pháp đo FCS, kỹ thuật đo phổ tương quan thăng giáng dựa trên tín hiệu tán xạ (phổ tương quan tán xạ - Scattering Correlation Spectroscopy
(SCS)) của các hạt nano được phát triển trong thời gian gần đây [145-147]. Nguyên lý và cấu hình hệ đo của hai phương pháp là tương tự nhau. Sự khác nhau chủ yếu là tương quan huỳnh quang FCS dựa trên sự thăng giáng huỳnh quang, còn tương quan tán xạ SCS dựa trên sự thăng giáng của ánh sáng tán xạ cộng hưởng. SCS thích hợp để đặc trưng các hạt không phát quang như các hạt kim loại quí như nano vàng. Kết quả đo phân bố kích thước phù hợp với các kết quả nhận được từ đo đạc hiển vi điện tử truyền qua (TEM) [148].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Chấm lượng tử bán dẫn phát quang đã được tổng hợp nhiều tại Việt nam [149- 158]. Nano silica ứng dụng trong y sinh học cũng đã được các nhóm nghiên cứu tại Viện Hàn lâm Khoa học Việt nam, Đại học Thái nguyên nghiên cứu chế tạo [159, 160]. Cacbon nanodot ứng dụng trong hiện ảnh huỳnh quang và làm sensor quang hiện đang được các nhóm nghiên cứu tại trường Đại học Bách khoa Hà Nội [161], trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 [162, 163], trường Đại học Huế [164] quan tâm nghiên cứu.
Để khảo sát tính chất của hạt nano phát quang tại Việt nam hiện nay, các nhà nghiên cứu tại Việt nam chỉ tập trung để đặc trưng các tính chất khối của mẫu. Kích thước hạt chủ yếu được khảo sát trên cơ sở các phương pháp đo TEM, SEM, DLS. Phương pháp FCS đạt độ nhạy đến mức độ đơn hạt/đơn phân tử, cho phép chỉ ra tính chất của đơn hạt cũng như tính không đồng nhất của các hạt nano có trong mẫu, có khả năng ứng dụng lớn để nghiên cứu các tương tác giữa hạt nano và các đối tượng y sinh học nhưng hiện nay do không có hệ đo nên dẫn đến phương pháp không thể tiếp cận và có kết quả đo đạc ngay tại Việt nam.
1.4. Kết luận phần tổng quan
Từ các phần đã trình bày, có thể thấy yêu cầu đặc trưng kích thước đặc biệt là kích thước thuỷ động lực học luôn được đặt ra khi nghiên cứu các hạt nano (phát quang hoặc không phát quang). Tuy nhiên, các phương pháp xác định thông dụng thường không gắn với tính chất phát quang của hạt. Phương pháp đo FCS cho phép đo đạc ở mức độ đơn phân tử/đơn hạt, thích hợp để khảo sát các quá trình xảy ra trong thể tích rất nhỏ. Đây là phương pháp đo gắn với các đối tượng phát quang, đã được ứng dụng trên thế giới, nhưng hiện khó tiếp cận tại Việt nam.
Với mục tiêu xây dựng một phương pháp đo mới ở Việt nam để nghiên cứu hạt nano phát quang, hỗ trợ cho các nghiên cứu cũng như các yêu cầu khảo sát các tính chất hóa lý của các vật liệu nano trong và sau quá trình chế tạo, các nội dung cụ thể của luận án này bao gồm:
- Xây dựng hệ đo FCS đáp ứng yêu cầu thu tín hiệu từ đơn phân tử/đơn hạt. - Xác định các thông số của hệ đo.
- Khảo sát khả năng ứng dụng hệ đo trong nghiên cứu phản ứng giữa các phân tử sinh học.
- Khảo sát kích thước thủy động lực học của chấm lượng tử bán dẫn trong môi trường nước và môi trường có độ nhớt cao bằng phương pháp FCS trên cơ sở hệ đo đã xây dựng.
- Khảo sát kích thước của một số loại hạt nano khác với chấm lượng tử bằng phương pháp FCS (trên cơ sở đo huỳnh quang) hoặc SCS (trên cơ sở đo tán xạ). Các hạt này bao gồm: nano silica mang tâm màu, nanocacbon phát quang, nano silica không mang tâm màu và nano bạc.
- Nghiên cứu ở mức độ đơn hạt/đơn phân tử tính chất của chất màu và chấm lượng tử qua hiệu ứng antibunching.
CHƯƠNG II. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Hoá chất và dụng cụ thí nghiệm
Bảng 2.1 và bảng 2.2 liệt kê các hóa chất chính và dụng cụ thí nghiệm sử dụng trong luận án.
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất chính
STT Tên hoá chất Nguồn gốc
1 Rođamin B Hãng Sigma - Aldrich
2 Rođamin 6G Hãng Sigma - Aldrich
3 Các chấm lượng tử CdTe Hãng PlasmaChem GmbH
4
Chấm lượng tử CdTe/CdS Viện KH Vật liệu, Viện
HLKHCNVN 5
Nano silica mang tâm màu (SiO2-RB) TS. Phạm Minh Tân, Viện Vật lý chế tạo
6 Bạc nitrat AgNO3, > 99.9% Hãng Sigma-Adrich
7 Trinatri xitrat đihyđrat C6H5Na3O7.2H2O, 99% Hãng Sigma-Adrich
8 Natri bohyđrua NaBH4, 99%, Hãng Sigma-Adrich
9 Natri hydroxit NaOH, 99% Hãng Merck
10 Tetraetoxy silan (TEOS), Si(OC2H5)4) 99,0% Hãng Sigma-Aldrich
11 Amoni hydroxit NH4OH 25% Hãng Merck
12 Cồn tuyệt đối C2H5OH, tiêu chuẩn ACS Hãng Merck
13 Đường tinh luyện Việt Nam
14 ADN phát quang (gắn phân tử chất màu) Các hãng Invitrogen, 15
ADN bổ trợ (gắn biotin) Hãng Integrated DNA
Technologies
16 Streptavidin Hãng Sigma-Aldrich
17 Đệm SSPE 20X, pH (25oC) 7,4 UltraPure Hãng Invitrogen 18
Chấm lượng tử CdTe/CdS Viện KH Vật liệu,
Viện HLKHCNVN 19 Saccarozơ C12H22O11, tinh khiết phân tích Trung Quốc
Bảng 2.2. Danh mục dụng cụ thiết bị
STT Dụng cụ - Thiết bị Nguồn gốc
1 Máy khuấy từ gia nhiệt Trung Quốc
2 Cân phân tích 4 số Shimadzu, Nhật Bản
3 Máy ly tâm để bàn Centurion Scientific, Anh
4 Lò vi sóng dân dụng, công suất cực đại 700 W LG, Việt Nam 5 Đèn hơi natri, vạch phổ chủ yếu là vạch bội đôi
2.2. Tổng hợp các hạt nano 2.2.1. Tổng hợp nano silica 2.2.1. Tổng hợp nano silica Nano silica không chứa tâm màu
Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp nano silica không phát quang.
Nano silica không phát quang được tổng hợp từ TEOS bằng quá trình thủy phân và ngưng tụ alkoxit silic trong môi trường ancol với sự có mặt của xúc tác bazơ NH4OH theo phương pháp sol-gel (kỹ thuật Stober) [31, 32] như sau:
0,1 ml TEOS được thêm vào hỗn hợp gồm 5 ml cồn tuyệt đối, 200 l NH4OH 25% trong khi khuấy mạnh để bắt đầu tạo thành hạt nano silica. Sau 1 giờ, thêm tiếp 0,1 ml TEOS. Phản ứng được tiếp tục trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó ly tâm ở 8500 vòng/phút trong 10 phút để thu hạt nano silica, rửa 3 lần bằng cồn tuyệt đối và phân tán lại trong nước. Các hạt lớn được loại bớt bằng cách ly tâm ở 3000 vòng/phút và loại bỏ kết tủa. Sơ đồ tổng hợp được trình bày trong hình 2.1.
Nano silica mang tâm màu
Nano silica phát quang mang tâm màu RB với các nhóm chức bề mặt –OH, –SH, –NH2, –COOH hoặc hỗn hợp nhóm chức –NH2 và –OH được cung cấp bởi TS. Phạm Minh Tân, Viện Vật lý [35]. Mẫu được chế tạo theo phương pháp Stober có sự hỗ trợ của các chất hoạt động bề mặt. Chi tiết phương pháp tổng hợp theo tài liệu [35] được trình bày trong sơ đồ tổng hợp trên hình 2.2.
AOT : Sodium dioctyl sulfosuccinate, C20H37O7NaS (chất hoạt động bề mặt)
MTEOS : Metyl trietoxy silan CH3-Si(OC2H5)3
RB : Rođamin B (chất màu); DMSO : Đimetyl sunfoxit (CH3)2SO; NH4OH : Dung dịch amoniac 25 – 28 %;
APTEOS : (3-Aminopropyl) trietoxy silan H2N-(CH2)3-Si(OC2H5)3
HS – PEG – COOH : Polyetylen glycol có 2 nhóm chức -SH và –COOH HS-(CH2CH2O)n -CH2COOH
Hình 2.2.Sơ đồ tổng hợp nano silica phát quang với các nhóm chức bề mặt khác nhau từ tài liệu tham khảo [35].
Lượng chất phản ứng cụ thể (tài liệu [35]) được trình bày trong bảng 2.3 và bảng 2.4.
Bảng 2.3. Điều kiện tổng hợp nano silica với nhóm chức bề mặt –OH [35]
Ký hiệu mẫu NH4OH (l) AOT (g) Butanon-2 (l) MTEOS (l) H2O (ml) SB20 20 0,22 400 400 20 SB30 30 0,44 800 SB40 40 0,55 1000 SB60 60 0,66 1200
Bảng 2.4. Điều kiện tổng hợp nano silica với nhóm chức bề mặt khác nhau [35]
Ký hiệu mẫu NH4OH (l) APTEOS (l) AOT (g) Butanon-2 (l) MTEOS (l) H2O (ml) SiO2 –NH2&OH SiO2 –NH2 SiO2 –COOH - 30 0,44 800 400 20 SiO2 –SH 30 - 0,44 800 400 20 2.2.2. Tổng hợp cacbon nanodot
Cacbon nanodot (CND) được tổng hợp từ các phân tử đường saccarozơ theo phương pháp nhiệt phân sử dụng lò vi sóng gia dụng theo qui trình tương tự như trong tài liệu [165, 166]. Cụ thể như sau:
Hình 2.3. Sơ đồ tổng hợp cacbon nanodot.
Đường tinh luyện (1 g) được đưa vào lò vi sóng gia dụng với năng lượng cực đại (700 W) trong vòng 5 phút. Cacbon hóa mẫu xảy ra với sự hình thành chất rắn màu nâu đen. Sau khi để nguội, thêm vào mẫu 50 ml nước. Lọc dung dịch thu được qua màng lọc 0,22 m. Mẫu sau tổng hợp được xử lý bằng thẩm thấu (dialysis) qua màng 10 kDa MWCO với nước cất hai lần để loại các phân tử kích thước nhỏ hơn 10 kDa,. Quá trình thẩm thấu được thực hiện 3 lần, mỗi lần 24 giờ. Sơ đồ tổng hợp được trình bày trong hình 2.3.
2.2.3. Tổng hợp nano bạc dạng lăng trụ
Nano bạc dạng lăng trụ (AgNPr) với kích thước và hình dạng tương đối đồng đều được tổng hợp bằng phương pháp plasmon định hướng sử dụng đèn hơi natri làm nguồn chiếu sáng [167]. Phương pháp này không sử dụng các polyme bảo vệ trong
quá trình tổng hợp. Quá trình tổng hợp sử dụng ion OH- để đạt được phân bố kích thước hẹp.
Hình 2.4. Sơ đồ tổng hợp nano bạc dạng lăng trụ.
Sơ đồ tổng hợp AgNPr được trình bày trên hình 2.4. Hỗn hợp gồm AgNO3 (400l, 10mM), trinatri xitrat (400 l, 100 mM) và nước khử ion (38,8 ml, 18 Mcm-1) được khuấy mạnh ở nhiệt độ phòng bằng máy khuấy từ. Sau đó, 400 l hỗn hợp gồm NaBH4 (8 mM) và NaOH (100 mM) được thêm từng giọt vào hỗn hợp trên. Hỗn hợp phản ứng được chiếu sáng ngay lập tức với đèn hơi natri trong vòng 2 giờ và được khuấy liên tục trong quá trình chiếu sáng. Sản phẩm sau tổng hợp được