2.4.1. Phổ huỳnh quang
Phổ huỳnh quang cho biết vùng phát xạ của chất màu hoặc các hạt nano. Từ các thông tin này, lựa chọn các cấu tử quang học và các đầu thu cho hệ đo FCS phù hợp với đối tượng cần đo. Các kết quả đo tính chất phát quang của chất màu và hạt nano sử dụng trong luận án được thực hiện trên phổ kế huỳnh quang Cary Eclipse (Varian) tại Viện Vật lý, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam. Nguồn kích thích của Cary Eclipse là đèn Xenon. Dải phổ cho phép đo đạc của máy là từ 200 nm đến 900 nm.
Thời gian sống huỳnh quang
Thời gian sống của chấm lượng tử CdTe được xác định từ đo đường chống bó (antibunching) của chấm lượng tử, thực hiện trên hệ FCS tự xây dựng. Đây là thời gian sống trung bình của các đơn hạt.
2.4.2. Phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến UV-VIS
Phổ hấp thụ được sử dụng để khảo sát bước sóng kích thích phù hợp cho đối tượng cần đo. Phổ hấp thụ được đo tại Viện Vật lý, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam trên máy UV-2600 (Shimadzu). Dải phổ đo được của máy nằm trong khoảng 190 nm – 1400 nm.
2.4.3. Hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Trong luận án, TEM được sử dụng để tìm hiểu kích thước vật lý của các chấm lượng tử. Ảnh TEM được chụp trên máy JEM1010 (JEOL) ở thế gia tốc 80 kV tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương hoặc máy JEM-2100 (JEOL) ở thế gia tốc 200 kV tại Viện Khoa học Vật liệu. Mẫu đo TEM được chuẩn bị bằng cách nhỏ một giọt dung dich mẫu lên lưới đồng phủ cacbon và làm khô ở nhiệt độ phòng.
2.4.4. Tán xạ ánh sáng động (DLS)
Tán xạ ánh sáng động và phân bố kích thước hạt của mẫu được xác định trên thiết bị Zetasizer-Nano ZS (Malvern) tại Viện Khoa học Vật liệu. Nguồn sáng là laze bán dẫn bước sóng 532 nm, công suất 10 mW. Thiết bị có dải đo kích thước từ 0,6 nm – 6,0 µm. Góc thu tán xạ = 173o. Kết quả đo tán xạ ánh sáng động cho biết kích thước thủy động lực học của hạt và phân bố kích thước hạt.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả xây dựng và đặc trưng hệ đo FCS
3.1.1. Cấu hình hệ đo FCS
Các chi tiết quang học của hệ đã được lựa chọn để phù hợp với mục tiêu ứng dụng đo đạc cho các đối tượng phát quang trong vùng ánh sáng nhìn thấy (300 – 700 nm) và đảm bảo đo đạc được đến mức độ đơn phân tử với độ ổn định cao và hiệu suất thu tín hiệu cao.
-Laze kích: Hệ FCS xây dựng trong luận án sử dụng kích thích đơn photon. Lựa chọn laze Nd:YAG loại compact bơm bằng laze bán dẫn của hãng Sinolaser (Trung Quốc) phát liên tục ở bước sóng cơ bản 532 nm, công suất 100 mW, đường kính chùm laze 2,5 mm. Laze được ổn định về cường độ dòng điện nuôi và nhiệt độ của cả khối bằng pin Peltier cùng mạch điện phản hồi. Loại laze này gọn nhẹ, dễ sử dụng, giá thành không quá cao.
Bằng cách sử dụng các phin lọc trung tính có độ sâu quang học (OD) từ 0,5 đến 3,0 đặt sau đầu phát laze, cường độ laze có thể thay đổi trong khoảng từ 100 mW đến 100 W. Cường độ laze nằm trong khoảng vài W đến vài mW trước khi đưa vào vật kính hiển vi.
-Bộ lọc không gian: Pinhole đặt giữa hai thấu kính hội tụ, tại tiêu điểm của mỗi thấu kính. Pinhole có đường kính 20 μm, có thể dịch chuyển theo ba chiều nhờ đặt trên một giá dịch chuyển z có độ dịch chuyển cỡ mili-mét và một giá vi dịch chuyển xy có độ dịch chuyển cỡ μm để điều chỉnh chính xác vị trí của pinhole. Sau khi đi qua bộ lọc không gian, chùm laze có dạng Gauss ở mode TEM00 (hình 3.1), chuẩn trực; kích thước chùm được mở rộng > 6 mm, lớn hơn kích thước cửa sổ (aperture) của vật kính hiển vi.
-Các gương lái là các gương bạc với độ phản xạ lớn hơn 90% được sử dụng để dẫn chùm laze, được lắp trên các giá gương chuyên dụng có thể chỉnh hướng của chùm tia laze.
-Gương lưỡng chiết: phân tách giữa chùm sáng kích thích và tín hiệu huỳnh quang. Chùm laze kích thích phản xạ gần như hoàn toàn trên gương này nhưng huỳnh quang từ mẫu thì truyền qua.
-Gương điện môi băng rộng: được đặt sau gương lưỡng chiết, có tác dụng phản xạ chùm laze tới vật kính hiển vi, cũng đồng thời phản xạ huỳnh quang phát ra từ mẫu tới phần thu tín hiệu. Lựa chọn dùng gương hiệu suất cao để nâng cao hiệu suất thu nhận ánh sáng huỳnh quang rất yếu từ từng phân tử chất màu hoặc hạt nano đơn lẻ.
Hình 3.1. Bộ lọc không gian tạo chùm sáng ở mode TEM00.
-Vật kính hiển vi: là loại dùng trong dầu của hãng Edmund Optics có giá thành thấp hơn khoảng 10 lần loại so với vật kính có cùng tính năng thường dùng trong kính hiển vi quang học của các hãng lớn như Nikon, Olympus. Vật kính có độ phóng đại 100x và khẩu độ số (numerical aperture, NA) = 1,25. Khẩu độ số lớn hơn 1 là yêu cầu cần thiết để đạt được độ phân giải cao và thể tích kích thích cỡ femto-lít. Các giá dịch chuyển giúp điều chỉnh vị trí của vật kính nhằm hội tụ chùm sáng kích thích tại vị trí mong muốn trong mẫu đo.
Hình 3.2 trình bày một phần của khối quang học kích thích mẫu và thu tín hiệu huỳnh quang, cho thấy vị trí lắp đặt gương lưỡng chiết, gương điện môi băng rộng và vật kính hiển vi.
1. Giá đỡ mẫu
2. Cọc đồng giữ giá đỡ mẫu 3. Vật kính hiển vi
4. Các giá đỡ và giá dịch chuyển vật kính
5. Gương điện môi băng rộng hiệu suất cao
6. Gương lưỡng chiết
Hình 3.2. Một phần khối quang học kích thích mẫu và thu tín hiệu huỳnh quang.
-Phin lọc phát xạ: phù hợp để đo mẫu phát quang ở vùng bước sóng > 550 nm.
-Thấu kính hội tụ trong phần thu tín hiệu huỳnh quang: thấu kính phẳng lồi, mạ chống phản xạ trong vùng từ 350 -700 nm có tiêu cự f = 150 mm.
-Pinhole trong phần thu tín hiệu huỳnh quang có đường kính 50 μm. Sử dụng pinhole trong phần thu để loại bớt các phần ánh sáng nằm ngoài vùng hội tụ của ánh sáng kích thích, giúp thu hẹp kích thước vùng quan sát. Về thực chất, đây là cấu hình của kính hiển vi đồng tiêu cho phép quan sát mẫu ở một vùng không gian 3 chiều với chiều z chỉ khoảng một vài μm.
Mẫu cố định tại một vị trí trên giá đỡ mẫu trong quá trình đo. Các cọc đỡ lớn có đường kính 2 inch được sử dụng cho mẫu và vật kính giúp giảm thiểu rung lắc.
Phin lọc phát xạ, thấu kính hội tụ, pinhole thu tín hiệu huỳnh quang được đặt trong các ống cố định trên các cọc quang học. Các ống này đảm bảo cho phần thu tín hiệu huỳnh quang không bị ảnh hưởng bởi ánh sáng từ bên ngoài. Phin lọc có thể tháo lắp dễ dàng bằng cách tháo lắp ống giữ.
Bảng 3.1. Các thành phần chính của hệ đo FCS đã xây dựng trong luận án
Thành phần Thông số Nguồn gốc
Nguồn kích thích
Kích thích đơn photon sử dụng laze Nd-YAG bơm bằng laze diode phát liên tục ở bước sóng 532 nm, công suất cực đại 100 mW
Trung Quốc Bộ lọc không gian Pinhole 20 m Thấu kính phẳng lồi f = 60 mm Thấu kính phẳng lồi f = 150 mm Thorlabs
Vật kính hiển vi Vật kính dùng trong dầu, độ phóng đại 100x, khẩu độ số NA = 1,25
Edmunds Optics Gương
lưỡng chiết
Truyền qua > 85% trong vùng ánh sáng 584-700 nm
Phản xạ > 90% trong vùng từ 380-550 nm.
Thorlabs
Gương điện môi phản xạ cao
Phản xạ trong vùng từ 400 nm đến 750 nm. Hiệu suất phản xạ > 99%
Thorlabs
Phin lọc phát xạ Phin lọc giao thoa băng dài truyền qua 80% trong vùng bước sóng > 550 nm, chặn ánh sáng trong vùng 220-550 nm.
Các phin lọc băng hẹp phù hợp với tính chất phát quang của đối tượng đo.
Thorlabs
Chroma
Cấu hình đồng tiêu
Pinhole kích thước 50 μm trong phần thu tín hiệu Thorlabs
Detector Đếm đơn photon dạng mô-đun, gồm 2 loại:
PMT APD Tự tích hợp Bộ khuếch đại cho PMT Hệ số khuếch đại G = 10 Phối hợp trở kháng 50 Mô-đun đếm photon PicoHarp 300
Mô-đun tự thiết kê dựa trên mảng logic lập trình được (FPGA).
PicoQuant Tự chế tạo
Các chi tiết quang học và cơ quang được sử dụng hầu hết đều của hãng Thorlabs (Mỹ), giá thành không quá cao, giúp giảm kinh phí xây dựng hệ. Đồng thời, một số linh kiện trong hệ được tự chế tạo, nhằm giảm giá thành và chủ động trong quá trình xây dựng hệ mà vẫn đảm bảo gá lắp vững chắc và ổn định hệ quang học và đầu thu. Các linh kiện này bao gồm:
- Giá dịch chuyển hai chiều xy cho phép dịch chuyển cỡ μm và giá dịch chuyển một chiều z cho phép dịch chuyển cỡ mili-mét được dùng để lắp đặt pinhole trong bộ lọc không gian.
- Các giá vi dịch chuyển ba chiều để chỉnh vị trí các đầu thu APD (sensor trong đầu thu APD có kích thước cỡ 2 mili-mét nên để chỉnh APD đúng vị trí cần dùng các giá vi dịch chuyển).
- Cọc đỡ, giá dịch chuyển mẫu.
3.1.2. Khảo sát kích thước của thể tích đo
FCS là phương pháp dựa trên tín hiệu của từng phân tử hoặc một số ít các phân tử. Để có thăng giáng tín hiệu huỳnh quang tối ưu, ngoài việc đáp ứng yêu cầu về sự ổn định của nguồn laze và độ nhạy cao của các đầu thu, thể tích đo là yếu tố rất quan trọng. Thể tích đo trong phương pháp FCS cần giảm xuống cỡ femto-lít để giảm số phân tử được quan sát. Trong phương trình đường tương quan, cần xác định các thông số cụ thể của thể tích đo (r0, z0) tương ứng với cấu hình hệ đã thiết lập. Xác định r0, z0 trực tiếp dựa trên quan sát vết hội tụ của laze tương đối phức tạp. Theo tài liệu tham khảo [168, 169], phương pháp đơn giản hơn để xác định r0, z0 là dựa vào thời gian khuếch tán D của một loại phân tử chất màu có hệ số khuếch tán D đã biết trước (sử dụng phương trình 1.17). Chất màu cần có hiệu suất lượng tử cao đảm bảo tín hiệu thu được đủ mạnh, có tính chất quang phù hợp với dải phổ của đối tượng cần nghiên cứu. Cấu hình hệ đo đã thiết lập với nguồn laze kích thích ở bước sóng 532 nm, hệ quang học và các đầu thu phù hợp để thu tín hiệu huỳnh quang tại vùng bước sóng trên 565 nm. Với cấu hình này, r0, z0 được xác địnhdựa vào dung dịch Rođamin B (RB) trong nước ở nồng độ rất loãng (< 10-7 M). Phân tử RB hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 532 nm, cho tín hiệu huỳnh quang mạnh tại bước sóng max khoảng 580 nm (hình 3.4), hiệu suất lượng tử 0,5 trong etanol [170].
Hình 3.4. Phổ hấp thụ (đường đứt nét) và phổ huỳnh quang (đường liền nét) của RB trong nước.
Hình 3.5 trình bày đường tương quan huỳnh quang điển hình cho dung dịch RB ở 25oC đo trong 300s trên hệ FCS tự xây dựng trong luận án. Các đường thực nghiệm đều phù hợp với hàm lý thuyết G(τ) cho trường hợp khuếch tán thường của các phân tử (xem phương trình 1.14 phần tổng quan):
Tiến hành khớp đường tương quan thực nghiệm với hàm tương quan lý thuyết G() theo phương pháp bình phương tối thiểu không tuyến tính thu được các giá trị thời gian khuếch tán D, số phân tử trung bình trong thể tích đo N = G(0) (bảng 3.2) và tỉ lệ hình học của thể tích đo = r0/z0.
Giá trị hệ số khuếch tán của RB ở 25oC theo tài liệu tham khảo là (4,5 0,4) x 10-6 cm2s-1 [168]. Bán kính của thể tích quan sát r0, kích thước thể tích quan sát theo phương trục z0 và thể tích hiệu dụng Veff tính theo các phương trình 1.15 và 1.17 trình bày trong phần tổng quan. Các giá trị điển hình được trình bày trong bảng 3.3. Kết quả cho thấy giá trị của r0 xấp xỉ giới hạn nhiễu xạ (/2NA = 532 nm/2/1,25 213 nm), thể tích đo của hệ phù hợp với lý thuyết (cỡ femto-lít) và phù hợp với thông số của các hệ FCS tương tự trên thế giới [171].
Bảng 3.2. Các giá trị đo FCS cho RB
τD (μs) 36,0 0,7
N = 1/ G(0) 1,61 0,05
Nồng độ hiệu dụng (nM) 3,2 0,1
Bảng 3.3. Các thông số của thể tích đo
Thông số Hệ FCS trong luận án Tham khảo [171]
ω = r0/z0 0,11 0,11
r0 (nm) 255 300
z0 (μm) 2,32 2,8
Veff (fl) 0,84 1,4
3.1.3. Hệ số khuếch tán của chất màu R6G
Hệ số khuếch tán của Rođamin 6G (R6G) được xác định dựa trên D của đường tương quan cho R6G với giá trị , r0 của thể tích đo đã biết. Kết quả cho phép đánh
giá độ chính xác của kết quả đo trên hệ đo đã xây dựng. Chất màu R6G phát quang mạnh ở max khoảng 560 nm, hiệu suất lượng tử trong etanol = 0,95 [170]. Tính chất hấp thụ và phát quang của R6G (hình 3.6) tương tự RB, do đó không cần thay đổi thành phần quang học của hệ FCS, và giá trị của r0 được giữ nguyên.
Hình 3.6. Phổ hấp thụ (đường đứt nét) và phổ huỳnh quang (đường liền nét) của R6G trong nước.
Đường FCS của R6G trình bày trên hình 3.7. Kết quả cho thấy đường tương quan thực nghiệm phù hợp với phương trình lý thuyết. Các giá trị đo cho R6G được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Các giá trị đo FCS cho R6G
Thông số Giá trị
τD (μs) 41,0 0,9
N = 1/ G(0) 0,50 0,08
Nồng độ hiệu dụng (nM) 1,0 0,2
Bảng 3.5. Hệ số khuếch tán của R6G trong nước so sánh với tài liệu tham khảo D (25oC)
(x 10-6 cm2s-1) Phương pháp đo
Tài liệu tham khảo Năm xuất bản 2,8 ± 0,3 FCS [172] 1974 3,0 FCS [173] 1979 2,9 ± 0,7 NMR [174] 2001 4,0 Cực phổ [175] 2001
4,14 ± 0.01 Dòng chảy mao quản [176] 2002
4,3 ± 0,4 NMR và FCS [168] 2008 4,14 ± 0,05 FCS hội tụ kép [177] 2008 3,72 ± 0,03 (200 M)* 3,91 ± 0,06 (100 M) * 4,02 ± 0,12 (50 M) * NMR [178] 2014 4,0 ± 0,1 FCS Luận án 2021 * Giá trị D phụ thuộc nồng độ
Từ thời gian khuếch tán D đo được và dựa trên giá trị r0 đã được xác định, tính được hệ số khuếch tán của R6G (theo phương trình 1.17). Hệ số khuếch tán của
R6G trong tài liệu tham khảo có nhiều giá trị khác nhau (bảng 3.5). Một số tác giả trước đây công bố các giá trị hệ số khuếch tán D 3 x 10-6 cm2s-1 [172-174], tuy nhiên các giá trị D như vậy đã được xác định là chưa chính xác [168]. Hệ số khuếch tán của R6G đo được trên hệ FCS tự xây dựng phù hợp với các giá trị trình bày trong các tài liệu tham khảo gần đây.
Như vậy, với hệ FCS tự xây dựng, giá trị thời gian khuếch tán từ đường tương quan đủ tin cậy để tính toán hệ số khuếch tán và từ đó tìm kích thước của các phần tử phát quang.
Giá trị N trong bảng 3.2 và bảng 3.4 cho phép kết luận hệ đo thiết lập đảm bảo tiêu chí của hệ đo FCS, số phân tử trong thể tích đo đủ nhỏ để phép đo đạt đến mức độ đơn phân tử. Các đường tương quan huỳnh quang được chuẩn hóa (G(0) =1) (hình 3.8) cho phép so sánh trực quan sự khác nhau về đặc tính động lực học của các chất màu RB và R6G. Chất màu có hệ số khuếch tán lớn hơn có đường tương quan suy giảm nhanh hơn và τD nhỏ hơn.
Hình 3.8. Đường tương quan chuẩn hóa của R6G và RB.
Hàm lý thuyết thể hiện bằng đường liền nét.
(s) G()
3.1.4. Ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ chất màu
Đường FCS đo đạc cho các dung dịch có nồng độ chất màu khác nhau được trình bày trong hình 3.9.
Hình 3.9. Đường tương quan của các chất màu RB (hình a và b)