Sự biến màu của tỏi trong các sản phẩm dầm dấm chịu tác động từ rất nhiều các yếu tố khác nhau: ảnh hưởng của quá trình thu hái và bảo quản sau thu hái, vận chuyển, các ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ, pH trong các quá trình chế biến và bảo quản, … Tóm lại, có thể thấy rất rõ quá trình biến màu của tỏi trong các sản phẩm bị ảnh hưởng bởi các tác động: cơ lý (va đập, nhiệt độ, …), hóa sinh (enzyme, pH, …).
1.2.1.1. Sự biến màu do quá trình thu hái và bảo quản sau thu hái
Thành phần các chất trong tỏi thay đổi sau thu hái là một trong những nguyên nhân ảnh hưởng trực tiếp đến sự hư hỏng của tỏi hay sự biến màu của tỏi trong các sản phẩm dầm dấm. Các quá trình hô hấp có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình bảo quản và tồn trữ tỏi sau thu hái (thay đổi hàm lượng dinh dưỡng, mật độ nước, thành phần hóa sinh, vi sinh, …). Một nghiên cứu của các nhà khoa học Ấn Độ cho thấy khi bảo quản tỏi trong kho lạnh ở 32-36oF và độ ẩm tương đối 60- 70% thì sự tổn thất là 12.5%, tại 1-5oC và độ ẩm 75% thì sự tổn thất là 42,4% trong nhiệt độ môi trường xung quanh, kết quả của nghiên cứu này cho thấy chất lượng tỏi không cao khi độ ầm trong quá trình bảo quản cao [1], tuy nhiên, viêc bảo quản
22
ở nhiệt độ thấp cũng chính là một trong những nguyên nhân dẫn đến gia tăng sự biến màu của tỏi. Theo nghiên cứu của Kopsell, Randle và Eiteman năm 1999 đã cho thấy một lượng lớn Isoalliin gia tăng đáng kể khi hành và tỏi được bảo quản ở nhiệt độ thấp khoảng 5℃ [18]. Kết luận này cũng gần như trùng khớp với nghiên cứu của Lawson và các cộng sư (1991) chỉ ra rằng sự ra tăng hình thành thiosunfinates từ isoalliiin trong tỏi được bảo quản ở nhiệt độ 3-4oC trong 2 tuần là đáng kể và tỏi dễ bị phủ xanh hơn khi bảo quản ở nhiệt độ thường [19]. Chế độ bảo quản lạnh cho thấy sự thay đổi rõ rệt về màu sắc. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Martins và cs. (2016) về điệu kiện bảo quản ảnh hưởng đến sự thay đổi màu sắc của tỏi. Cụ thể, nghiên cứu khẳng định thời gian lưu trữ và chế độ bảo quản có tác động trực tiếp đến sự thay đổi màu sắc của tỏi nguyên liệu vì ở điều kiện bảo quản khác nhau ảnh hưởng đến khả năng hình thành sản sinh isoalliin, một tiền chất cho quá trình biến đổi màu sắc không mong muốn của tỏi. Bảo quản ở 50C làm cho S-alk(en)ylcystein sunfoxit tăng đến 30% (bao gồm: alliin, isoalliin, methiin, …), đặc biệt sự gia tăng này cao hơn so với bảo quản ở nhiệt độ thường (230C), đây cũng là tác nhân ảnh hưởng đến sự tạo thành màu xanh của tỏi khi alliin và isoalliin chuyển hóa thành allicin. Ngoài ra, bảo quản ở nhiệt độ thấp trong thời gian dài là nguyên nhân gây ra hiện tượng tổn thương lạnh đối với tỏi. Khi bị tổn thương, cấu trúc tế bào bị phá vỡ tạo điều kiện cho các enzyme được giải phóng (aliinase, POD, PPO), và chuyển hóa các chất gây biến màu cho tỏi [20]. Ở một số nghiên cứu về tỏi ngâm, tỏi muối chua (Rejano và cs., 2006; Block, 2010; Lee và cs, 2007) đã chỉ ra sự tạo thành màu xanh lá cây của tỏi bị ảnh hưởng trong quá trình bảo quản. Hàm lượng isoalliin tăng lên kèm theo sự giảm Glu-PEC trong quá trình bảo quản lạnh (40C), điều này kèm theo đó chính là sự ra tăng màu xanh trong khi bảo quản. Màu xanh giảm thấy rõ rệt khi tỏi được bảo quản ở điều kiện phòng hay ở nhiệt độ bảo quản cao hơn (350C trong 30 ngày) [21] [22] [23].
Cơ chế phủ xanh của tỏi cũng đã được rất nhiều các nhà khoa học nghiên cứu và báo cáo. Năm 1986, Lukes đã chỉ ra rằng màu xanh của tỏi là kết quả của quá trình tích tụ của S- (E-1-propenyl)- L- cysteine sulfoxide (isoaliin), các nghiên cứu sau này chỉ ra rằng sự xanh hóa tỏi do tích tụ của alliin (Kubec và cs., 2004; Imai và cs., 2006). Imai cũng khẳng định sản phẩm của quá trình chuyển hóa alliin dưới tác động của alliinase là allicin tạo ra chất màu. Trong các bài báo nghiên cứu đều chỉ ra rằng hiện tượng xanh lá cây của tỏi có liên quan đến việc bảo quản trong các điều kiện khác nhau gây ra. Mối quan hệ giữa tỏi và điều kiện bảo quản được kiểm chứng khi ở nhiệt độ bảo quản lạnh (30C hoặc 120C) tỏi hóa xanh ngay khi bị xay nhuyễn. Ngược lại, sự biến đổi màu giảm thấy rõ rệt khi bảo quản tỏi ở nhiệt độ phòng (23-280C) (Lukes, 1986) [24] [25] [26]
Yamazaki và cs. (2012) đã nghiên cứu xử lý bảo quản tỏi sau thu hoạch với các điều kiện bảo quản khác nhau cho kết quả khi bảo quản ở nhiệt độ 30C thì tỏi chuyển màu xanh lá khi xay nhuyễn sau 4 tuần bảo quản và tăng dần các ngày tiếp
23
theo. Hàm lượng isoalliin trong tỏi gia tăng đáng kể từ 0,4-5,3 mmol/100g trong suốt 18 tuần bảo quản ở nhiệt độ lạnh (30C) và mức độ đổi đổi màu là rất cao. Ông cũng đã chỉ ra rằng bảo quản ở 250C giúp tỏi không bị biến màu trong 10 tuần, và điều này ngược lại so với bảo quản lạnh (30C) khi mà tỏi sẽ nhanh chóng đổi màu sau 2-4 tuần [27]
Một trong những nguyên nhân làm giảm giá trị thương phẩm của củ tỏi là hiện tượng mọc mầm. Tỏi rất dễ mọc mầm, khi mọc mầm các hợp chất tạo nên độ thơm cay của tỏi sẽ được dùng để cung cấp cho mầm mới do đó sẽ làm giảm hương vị của tép tỏi. Theo nghiên cứu của Chhabia và cs., tỏi có mầm sẵn từ bên trong, vào thời điểm thu hái, mầm tỏi chỉ chiếm 10% chiều dài tép tỏi. Tỷ lệ này có thể duy trì trong 3 tháng ở nhiệt độ trên 250C hoặc dưới 00C, ngược lại ở nhiệt độ trong khoảng này mầm tỏi phát triển rất nhanh, đồng thời củ tỏi vẫn giữ được chất lượng tốt trong thời gian tối thiểu là 1 – 2 tháng [28]
Trong quá trình bảo quản việc kiểm soát hoạt độ nước trong tỏi cũng là một vấn đề cần lưu tâm, ảnh hưởng trực tiếp đến sự biến màu của tỏi. Nước là môi trường giúp cho ánh sáng chiếu tới rau quả có khả năng tán xạ lại tốt màu của rau quả đó để mắt người quan sát nhận được màu sắc. Hơn nữa, khi trong tế bào của rau quả có chứa nước, các chất chứa trong tế bào sẽ gây ra một áp suất - áp suất trương, tạo ra một độ căng nhất định đối với tế bào, làm tăng kích thước tế bào. Áp suất trương của nước bên trong tế bào sẽ sẽ giúp cho rau quả tươi có một độ căng bóng nhất định. Vậy nên, khi rau quả bị mất nước, môi trường tán xạ ánh sáng không tốt, áp suất trương giảm dẫn đến các hiện tượng sẫm màu và héo cho rau quả, cụ thể tỏi sẽ ngả màu vàng nâu nhạt trong quá trình tồn trữ và bảo quản, không còn màu trắng như khi vừa thu hoạch. [29]
Độ ẩm, nhiệt độ trong quá trình bảo quản cũng ảnh hưởng đến sự biến đổi màu sắc của tỏi: độ ẩm trong tỏi cao (65-75%) lại là nguyên nhân dẫn đến sự biến đổi các hợp chất có hoạt tính sinh học (organosulfua và allicin), khẳng định này hoàn toàn trùng khớp với các nghiên cứu của tác giả H.T.L. Hằng (2011). Một nghiên cứu khác của J. De La Cruz Medina và HS García cũng chỉ ra rằng bảo quản ở nhiệt độ thấp với độ ẩm hợp lý có thể kéo dài thời gian bảo quản nhưng lại làm tăng nhanh khả năng biến đổi màu của tỏi trong các sản phẩm [1], [30]
Ngoài ra trong quá trình thu hái và bảo quản, việc dập nát cơ học cũng là nguyên nhân gây biến đổi màu sắc của tỏi. Tỏi khi dập nát, các enzyme tự do bị giải phóng dẫn đến quá trình biến đổi sinh hóa dưới tác dụng của enzyme diễn ra nhanh hơn, màu bị biến đổi nhanh hơn.
1.2.1.2. Sự biến màu do phản ứng Maillard
Sự biến đổi màu này là kết quả của phản ứng Maillard các phản ứng hóa nâu phi enzyme xảy ra giữa đường khử và các acid amin có tự nhiên trong tỏi.
24
Hình 1.2. a. Cơ chế đổi màu trong phản ứng Mailard
Tuy chưa có một nghiên cứu nào chính thức về phản ứng Maillard diễn ra trong tỏi, nhưng dựa trên các thành phần, đặc tính của tỏi ta có thể thấy khả năng diễn ra phản ứng Maillard là cao.
Tỏi có chứa hàm lượng Glucide tương đối cao (23% Glucid), do vậy trong quá trình thu hái và bảo quản, tỏi bị biến đổi lên men một phần do tác động của nhiệt độ môi trường. Tỏi sau khi thu hái sẽ có xu hướng chuyển dần từ màu trắng sang màu vàng nâu nhạt (đậm hơn ở các phần đầu củ tỏi và phần tỏi có vết thương hở do tác động cơ học). Maillard là phản ứng tương đối điển hình trong sản phẩm chế biến.
Cường độ sẫm màu phụ thuộc vào bản chất của đường khử: đường 3C, 4C, 5C, 6C, …, các acid amin, nhiệt độ, pH và một vài yếu tố khác. [31]
Tỏi có tính chống oxh tốt, một phần nguyên nhân là do phản ứng Maillard diễn ra kìm hãm, ức chế hoạt động của chính các enzyme oxh-khử có trong tỏi (POD/PPO). Theo nghiên cứu của Billaud (2004), khả năng chống oxh của các hợp chất giữa acide amin (cysteine, glycine, isoleucine, lysine) phản ứng (Maillard) với các loại đường khác nhau ở điều kiện nhiệt độ phù hợp sẽ tạo ra các sản phẩm chống oxh ức chế hoạt động của enzyme oxh-khử, sự chuyển màu của sản phẩm khi này là màu do phản ứng Maillard chứ không phải do enzyme oxh khử chuyển hóa hình thành. [32]
Hơn nữa, sự gia tăng về nhiệt độ trong quá trình sản xuất tỏi dầm dấm (quá trình rót nóng dịch dầm) và trong quá trình sản xuất tỏi muối chua (do nhiệt lượng tỏa ra trong quá trình lên men) thúc đẩy các phản ứng xảy ra mạnh hơn, khiến cho tỏi có màu vàng nâu sẫm hơn so với tỏi sống.
25
1.2.1.3. Sự biến màu do enzyme
a. Sự biến màu do tác động của hệ enzyme oxh-khử (POD/PPO) [33] [34]
Enzyme polyphenol oxydase (PPO)
PPO được phát hiện đầu tiên ở nấm bởi Schoenbien năm 1856, là một metalloprotein có chứa nguyên tử đồng và thuộc vào nhóm enzyme oxi hóa khử, xúc tác phản ứng oxi hóa hợp chất phenolic với sự hiện diện của oxi tạo ra sản phẩn quinol, hình thành màu nâu trong trái cây và rau củ bị tổn thương nên PPO còn có tên gọi khác là enzyme hóa nâu.
PPO được tìm thấy trong phần lớn các mô thực vật như táo, nho, khoai tây, hạt cafe, ca cao, trong vi sinh vật bao gồm cả vi khuẩn và nấm, … Vị trí của PPO trong tế bào thực vật phụ thuộc vào loài, độ tuổi và độ chín của trái cây, rau củ.
PPO có 3 dạng chính tùy thuộc vào cơ chất đặc hiệu và cơ chế phản ứng của enzyme bao gồm:
- Tyrosine
- Catechol oxydase - Laccase
PPO có trọng lượng phân tử khác nhau phụ thuộc vào nguồn enzyme, phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme.
Sự hóa nâu bởi tác động của PPO có ảnh hưởng rất lớn tới chất lượng cảm quan của nhiều loại rau quả và các sản phẩm chế biến từ chúng. Điều đó dẫn tới sự giảm giá trị kinh tế đối với các trái cây và rau quả bị hóa nâu.
Enzyme peroxidase (POD)
POD là enzyme có chứa nhiều trong nhựa trái cây và gây ra hiện tượng hóa nâu vỏ trái, xuất hiện nhiều ở các loại như hạt sen, táo, lê, củ cải trắng, … và các cây họ Đậu.
POD là nhóm enzyme oxy hóa tách oxy từ peroxit (H2O2) hoặc các peroxit hữu cơ khác, có chứa Fe trong thành phần cấu tạo. Cơ chất được oxy hóa bởi POD thường là polyphenol hoặc các acid amin mạch vòng.
Hình 1.2. b. Cơ chế tác động của hệ enzyme polyphenol oxydase và peroxidase
26
AH2 + H2O2 → A + 2H2O
Cơ chế gây hóa nâu của enzyme POD tương tự như PPO, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân các hợp chất polyphenol để tạo ra quinol gây hóa nâu bề mặt các rau quả bị tổn thương.
Cơ chế tác động của hệ enzyme PPO và POD đối với sự biến đổi màu của hành và tỏi
Khi cắt thái tỏi, tại các phần tỏi bị tổn thương do tác động cơ học, enzyme POD và PPO chuyển sang thể tự do nằm trong tế bào chất được giải phóng, tiếp xúc với oxi không khí. Sự phối hợp giữa các giai đoạn oxi hóa và khử của sự hô hấp bị phá vỡ, các o-quinone được hình thành do sự oxi hóa các polyphenol có thể trùng hợp với các Aa để hình thành các sản phẩm có màu.
b. Sự biến màu do enzyme Alliinase
*/ Khái quát
-/ γ-Glutamyl cysteine: Là hợp chất cơ bản trong thành phần của tỏi. Nó là chất
khởi đầu cho một loạt các chất quan trọng khác như alliin, methiin hoặc S- allylcysteine.
-/ Alliin:
Công thức phân tử: C6H11NO3S Công thức cấu tạo:
Hình 1.2. c. Cơ chế tác động của hệ enzyme PPO đối với sự biến màu của rau quả
27
Alliin là một thành phần quan trọng cơ bản trong tỏi.
-/ Enzyme Alliinase
Alliinase nằm trong không bào của tế bào tỏi. Alliinase là một enzyme nhóm lyase- nhóm enzyme xúc tác cho các phản ứng phân cắt một nhóm nào đó ra khỏi hợp chất mà không có sự tham gia của nước, tức là không xảy ra sự thủy phân.
Phản ứng mà enzyme xúc tác có dạng: AB ⇔ A + B.
Enzyme này có thể chuyển hóa 2 cơ chất trong tỏi là alliin pHopt = 6,5 và iso alliin pHopt = 4,5.
Alliinase tan rất kém trong nước. Là enzyme không thuận nghịch, khoảng pH hoạt động tối ưu của enzyme này là 4,5-7,0. Ở pH = 4 enzyme này bị vô hoạt một phần, còn pH < 3 hoặc pH > 9 thì hoàn toàn bị vô hoạt. Ở nhiệt độ và pH tối ưu, alliinase có thể xúc tác tạo thành allicin hoàn toàn trong vòng 1 phút
Theo đó trong một kết quả nghiên cứu đã cho thấy Alliinase hoạt động mạnh mẽ ở điều kiện pH=7 và 80% hoạt tính được giữ lại khi khảo sát ở pH=6 và pH=8, có thể thấy kết quả nghiên cứu này hoàn toàn trùng khớp với một nghiên cứu trước đó của Gebreyohannes & Gebreyohannes năm 2013 khi mà tác giả đã khẳng định rằng E.Aliinase hoạt động tối ưu trong khoảng pH= 6-7, và bị vô hoạt hoàn toàn ở điều kiện pH>8 hoặc pH<3,4. Song song với điều kiện pH chính là nhiệt độ, những ảnh hưởng của nhiệt độ cũng đã được nghiên cứu và chỉ ra rằng Alliinase hoạt động mạnh mẽ nhất ở nhiệt độ 35oC và giữ được 80% hoạt tính ở 30oC và 40oC. Do vậy có thể thấy điều kiện tối ưu cho sự hoạt động của Alliinase ở pH=7, toC=35 [28] [4]
-/ Allicin
-/ Cơ chế hình thành allicin:
28
Cơ chế của phản ứng này đã được chứng minh lần đầu tiên bởi hai nhà khoa học Stoll và Seebeck vào năm 1948. Khi xay hay nghiền nát tỏi, enzyme alliinase được giải phóng, enzyme này tiếp xúc với alliin và xúc tác phản ứng.
Allicin dễ biến chất sau khi được tạo ra. Allicin sẽ tiếp tục chuyển hóa thành diallyl sulfide, diallyl disulfide, diallyl trisulfide, ajoene, vinyldithiines. Càng để lâu, càng giảm hoạt tính. Đun nấu sẽ đẩy nhanh quá trình này.
*/ Cơ chế tác động của hệ enzyme Alliinase đối với sự biến màu của hành và tỏi
Hình 1.2. f. Phản ứng phân giải Alliin trong tỏi
29
Cơ chế làm xanh tỏi bởi hệ E Alliin/Alliinase được chia làm 2 pha:
Pha enzyme: bao gồm các bước 1 và 2. Khi cắt thái tỏi, Alliinase xúc tác chuyển đổi Alliin và iso Alliin thành Thiosulfinate (Alliicin)
Pha hóa học: Alliicin lúc này sẽ phản ứng kết hợp với axit pyruvic và các axit amin trong tỏi hình thành nên các hợp chất màu xanh và màu vàng cho tỏi
Dựa theo sơ đồ trên, cơ chế hình thành màu xanh của tỏi bởi hệ enzyme Alliinase diễn ra sơ bộ bao gồm 7 bước: