38
2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của chế độ bảo quản đến chất lượng tỏi nguyên liệu
Nguyên liệu tỏi được định lượng 1 kg/mẫu, bọc bằng túi lưới. Thí nghiệm được bố trí với 4 mẫu sau: Tỏi TQ bảo quản thường (TQ1); Tỏi TQ bảo quản lạnh (TQ2); Tỏi HD bảo quản thường (HD1); Tỏi HD bảo quản lạnh (HD2). Mẫu bảo quản thường ở nhiệt độ 20 - 250C, độ ẩm 80 -85%. Mẫu bảo quản lạnh ở nhiệt độ 6 - 80C, độ ẩm 70 - 75%. Tiến hành đánh giá các chỉ tiêu chất lượng trong quá trình bảo quản, 3 ngày 1 lần. Các chỉ tiêu chất lượng được đánh giá gồm: Độ cứng (kg/cm2); Sự thay đổi mầu sắc (∆E*ab); Hàm lượng polyphenol tổng số (mg/100g); Hoạt lực enzyme allinase. Mỗi mẫu lặp lại 3 lần.
2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chế độ chần đến chất lượng tỏi
Nguyên liệu tỏi sau khi thu nhận về phòng thí nghiệm được bóc vỏ, rửa sạch, thái lát có độ dày 3mm; 5mm và 7mm và tiến hành chần trong dung dịch chần (dữ liệu chưa được công bố) ở 850C, 900C và 950C trong thời gian 80s, 90s và 100s. Sau khi chần tỏi được làm nguội nhanh trong nước lạnh, sau đó tiến hành xếp lọ và rót dịch dầm. Theo dõi chất sự biến đổi một số chỉ tiêu hoá lý của tỏi như: Độ cứng (kg/cm2); Sự thay đổi mầu sắc (∆E*ab); Hàm lượng polyphenol tổng số (mg/100g); Hoạt lực enzyme PPO, POD và allinase trong 28 ngày, tần suất 7 ngày/lần. Mỗi mẫu lặp lại 3 lần.
-/ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chần
Tỏi được thái lát độ dày 5mm sau đó chần ở 3 nhiệt độ 850C, 900C và 950C trong thời gian 90s. Mẫu kiểm chứng (KC) là mẫu không qua chần. Theo dõi chất sự biến đổi một số chỉ tiêu hoá lý của tỏi như: Độ cứng (kg/cm2); Sự thay đổi mầu sắc (∆E*ab); Hàm lượng polyphenol tổng số (mg/100g); Hoạt lực enzyme PPO, POD và allinase trong 28 ngày, tần suất 7 ngày/lần. Mỗi mẫu lặp lại 3 lần.
-/ Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chần
Tỏi được thái lát độ dày 5mm sau đó chần ở 3 nhiệt độ 900C trong thời gian 80s, 90s và 100s. Theo dõi chất sự biến đổi một số chỉ tiêu hoá lý của tỏi như: Độ cứng (kg/cm2); Sự thay đổi mầu sắc (∆E*ab); Hàm lượng polyphenol tổng số (mg/100g); Hoạt lực enzyme PPO, POD và allinase trong 28 ngày, tần suất 7 ngày/lần. Mỗi mẫu lặp lại 3 lần.
39
-/ Khảo sát ảnh hưởng của kích thước lát tỏi
Tỏi được thái lát độ dày 3mm, 5mm và 7mm sau đó chần ở nhiệt độ 900C trong thời gian 90s. Theo dõi chất sự biến đổi một số chỉ tiêu hoá lý của tỏi như: Độ cứng (kg/cm2); Sự thay đổi mầu sắc (∆E*ab); Hàm lượng polyphenol tổng số (mg/100g); Hoạt lực enzyme PPO, POD và allinase trong 28 ngày, tần suất 7 ngày/lần. Mỗi mẫu lặp lại 3 lần.
-/ Khảo sát ảnh hưởng của chất phụ gia bổ sung
Tỏi được thái lát độ dày 5mm, 5mm và 7mm, chần ở nhiệt độ 900C trong thời gian 90s, sau đó được bổ sung các chất phụ gia: CaCl2 0,1%, NaHCO3 (0,3% và 0,7%), Na2S2O5 (0,007%, 0.01% và 0,015%). Theo dõi chất sự biến đổi một số chỉ tiêu hoá lý của tỏi như: Độ cứng (kg/cm2); Sự thay đổi mầu sắc (∆E*ab); Hàm lượng polyphenol tổng số (mg/100g); Hoạt lực enzyme PPO, POD và allinase so với mẫu kiểm chứng khi chưa bổ sung chất phụ gia, được theo dõi trong 21 ngày, với tần suất 7 ngày/ lần. Mỗi mẫu lặp lại 3 lần.
Mẫu KC (KC)
Mẫu 1: CaCl2 0,1%; NaHCO3 0.3%; Na2S2O5 0.007% (1) Mẫu 2: CaCl2 0,1%; NaHCO3 0.3%; Na2S2O5 0.01% (2) Mẫu 3: CaCl2 0,1%; NaHCO3 0.3%; Na2S2O5 0.015% (3) Mẫu 4: CaCl2 0,1%; NaHCO3 0.5%; Na2S2O5 0.007% (4) Mẫu 5: CaCl2 0,1%; NaHCO3 0.5%; Na2S2O5 0.01% (5) Mẫu 6: CaCl2 0,1%; NaHCO3 0.5%; Na2S2O5 0.015% (6)
40
2.2.3. Phương pháp thí nghiệm và phân tích [40]
Bảng 2.2. a: Các phương pháp phân tích được áp dụng
Chỉ tiêu Phương pháp
Phương pháp cơ lý
Màu sắc Sử dụng thiết bị so màu sắc ColorLite sph860/sph900 của Đức
Độ cứng Máy đo cấu trúc thực phẩm TA-XT plus Phương pháp
hóa lý
Độ ẩm Sấy đến khối lượng không đổi Protein tổng số Phương pháp Kjeldal
Đường khử, đường tổng
Phương pháp Graxianop Polyphenol tổng
số Phương pháp đo màu sử dụng thuốc thử FOLIN-CIOCALTEU Xác định hoạt lực
enzyme oxh- khử
Phương pháp của Athiwat Chumyam và cs (2013)[41]
Xác định hoạt lực E.Alliinase
Phương pháp của Schwimmer và Weston 1961 (có chỉnh sửa)
2.2.3.1. Xác định độ cứng bằng máy đo cấu trúc
-/ Xác định độ cứng thịt củ bằng máy đo cấu trúc thực phẩm TA-XT plus
+/ Sử dụng đầu đo đường kính 8 mm, khoảng cách đâm xuyên là 0.5 cm, đơn vị kg/cm2 cho tỏi nguyên củ.
+/ Sử dụng đầu đo đường kính 8 mm, khoảng cách đâm xuyên là 0.1 cm, đơn vị kg/cm2 cho tỏi lát
-/ Phương pháp: Sử dụng máy phân tích cấu trúc thực phẩm TA-XT plus tại phòng thí nghiệm C4-205, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội.
-/ Các thông số sử dụng:
Đầu đo: HDP/90
Tốc độ trước nén: 2 mm/s Tốc độ nén: 1 mm/s
41
Tốc độ sau nén: 10 mm/s Tỉ lệ nén: 75%
-/ Cách tiến hành:
Bước 1: Khởi động máy tính và máy đo cấu trúc.
Bước 2: Mở ứng dụng đã được lập trình liên kết với máy đo sẵn có trong máy tính
Bước 3: Lắp đặt đầu đo và đĩa đo, đầu đo được sử dụng là đầu đo
Bước 4: Chọn chương trình với các thông số của lực cắt, tốc độ test, đầu đo cần sử dụng, … phù hợp với nguyên liệu mình cần phân tích.
Bước 5: Sau khi hoàn thành toàn bộ các thao tác set up, ấn RUN A TEST để bắt đầu thí nghiệm.
2.2.3.2. Xác định sự thay đổi màu sắc bằng máy đo màu
-/ Xác định màu sắc thịt củ bằng máy đo màu ColorLite sph860/sph900 của Đức.
Sự thay đổi mầu sắc (∆E*ab) được xác định theo công thức:
Trong đó: ∆L*= L*-L; ∆a*= a*-a; ∆b*= b*-b; Trong đó: L biểu thị cho cường độ màu có giá trị từ 0 (đen) đến 100 (trắng); a biểu thị cho dải màu từ xanh lá cây (-60) đến đỏ (+60); b biểu thị cho dải màu từ vàng (-60) đến xanh nước biển (+60).
-/ Nguyên lý hoạt động của thiết bị: Nguyên lý hoạt động của máy so màu là do hiện tượng phản xạ ánh sáng, với nguồn sáng tới là ánh sáng trắng gồm các tia đơn sắc cùng với những bước sóng khác nhau từ 400nm – 700nm, từ đỏ đến tím chiếu vào vật thể cần quan sát. Tia sáng phản xạ lại mắt người là tia sáng nào thì người quan sát sẽ nhìn ra vật thể màu đỏ.
Hệ màu CIE được xây dựng dựa trên khả năng cảm nhận màu của mắt người. Các giá trị Lab mô tả tất cả những màu mà mắt một người bình thường có thể nhìn thấy được. Lab được xem là một mô hình màu độc lập đối với thiết bị và thường được sử dụng như một cơ sở tham chiếu khi chuyển đổi một màu từ không gian màu này sang một không gian màu khác.
Không gian màu CIE LAB được sử dụng nhiều nhất cho việc đo màu vật thể. Các tone màu và độ bão hòa được vẽ trên các trục L*, a* và b*.
42
Trục độ sáng L* có giá trị từ 0 (đen ở đáy) đến 100 (trắng ở đỉnh). Trục L chỉ chứa thông tin về độ sáng của màu chứ không chứa giá trị màu.
Trục a chạy từ -a* (Green) đến +a* (Red) Trục b chạy từ -b* (Blue) đến +b* (Yellow)
Hình 2.2 b: Trục màu HunterLab -/ Cách tiến hành:
Sử dụng thiết bị so màu sắc ColorLite sph860/sph900 tại phòng thí nghiệm C4-209, Viện công nghệ sinh học và công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội.
Hãng sản xuất: ColorLite/ Đức
Mẫu tỏi phân tích màu được dùng gồm: Mẫu tỏi không xử lý được ngâm trực tiếp vào dịch dầm (mẫu kiểm chứng) và mẫu tỏi được xử lý chần- làm lạnh nhanh trước khi đưa vào ngâm với dịch dầm (mẫu xử lý)
Các lát tỏi được lấy ngẫu nhiên từ các bộ phận trên tép tỏi (phần ngoài và phần giữa tép tỏi), mỗi lát tỏi được đo 3 lần và lấy số liệu trung bình.
-/ Kết quả:
Kết quả hiển thị trên màn hình thiết bị.
2.2.3.3. Xác định hoạt độ enzyme Polyphenol oxidase và peroxidase
-/ Xác định hoạt lực enzyme polyphenol oxydase (PPO) và peroxidase (POD) theo phương pháp của Athiwat Chumyam và cs. (2013).
-/ Enzyme polyphenol oxidase
Dụng cụ:
Chày và cối sứ hoặc máy xay sinh tố bình Scott đựng hóa chất
43
Máy đo quang phổ Cuvet 10mm Thiết bị ổn nhiệt
Máy ly tâm có đặt được nhiệt độ lạnh
Hóa chất cần sử dụng
Dung dịch đệm phosphate kali 0.05M (pH=6.2) (Merck Đức) Dung dịch đệm phosphate kali 0.05M (pH=7.0) (Merck, Đức) KCl 1M
Poly-vinylpolypyrroridone 2% Catechol 0.2M (FluKa, Hoa Kỳ)
Phương pháp nghiên cứu
Mẫu tỏi được phân tích gồm có 3 mẫu: Mẫu tỏi không xử lý được ngâm trực tiếp vào dịch dầm (mẫu kiểm chứng), mẫu tỏi được xử lý chần- làm lạnh nhanh trước khi đưa vào ngâm với dịch dầm (mẫu xử lý) và mẫu tỏi tươi.
Thu nhận và thái tỏi thành miếng nhỏ hoặc nghiền nhỏ bằng cối và chày đã được làm sạch. Lấy chính xác 4g mẫu và đồng nhất trong 40ml dung dịch đệm phosphatkali 0,05M, pH = 6.2 trong 5 phút. Sau đó ly tâm 10 phút ở 12000rpm, 4℃. Thu nhận phần dịch nổi, đây là enzyme thô được sử dụng để xác định hoạt tính cho enzyme PPO và POD.
Cách tiến hành:
Để xác định hoạt tính PPO, ta sử dụng chất nền catechol 0.2M, thí nghiệm được thực hiện dựa theo phương pháp của Giang và Fu (1998)
Sử dụng hỗn hợp phản ứng (2ml) gồm:
1.3ml đệm phosphate kali 0,05M (pH=7.5) 0.2 ml catechol 0.2M
0.5 ml enzyme thô
Ống được ủ trong 5 phút ở 30℃.
Đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 420nm trong máy quang phổ nhìn thấy
Mẫu blank gồm có:
1.3 ml đệm phosphate kali 0.05M, pH = 7.5 0.2 ml catechol
44
Kết quả:
Hoạt độ enzyme được tính theo công thức: A = 1000.∆𝐴𝑏𝑠 𝑉.∆𝑡 Trong đó:
∆𝐴𝑏𝑠 là kết quả đo độ hấp phụ OD ∆𝑡 là thời gian phản ứng (5 phút) V là thể tích hỗn hợp phản ứng (2ml)
Lưu ý: Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme PPO cũng được Raphael
N. Alolga cùng các cộng sự áp dụng và cải tiến trong một bài báo nghiên cứu vào năm 2020. [29]
-/ Enzyme peroxidase Hóa chất cần sử dụng:
Dung dịch đệm natriacetate 0.01M, pH = 6.0 (Merck, Đức) Guaiacol 0.1% (Fluka, Hoa Kỳ)
H2O2 0,1% (Thuốc thử Carlo Erba, Ý)
Dung dịch đệm phosphatkali 0.05M, pH = 6.2 Poly-vinylpolypyrroridone 2%
Phương pháp nghiên cứu:
Tương tự như đối với phương pháp của enzyme PPO đối với 3 mẫu tỏi được phân tích: Thu nhận và cắt tỏi thành miếng nhỏ hoặc nghiền nhỏ bằng cối và chày đã được làm sạch. Lấy chính xác 4g mẫu và đồng nhất trong 40 ml dung dịch đệm phosphatkali 0.05M, pH = 6.2 trong 5 phút. Sau đó ly tâm 10 phút ở 12000rpm, 4℃. Thu nhận phần dịch nổi, đây là enzyme thô được sử dụng để xác định hoạt tính cho enzyme POD.
Cách tiến hành:
Hoạt tính POD, sử dụng guaiacol làm chất nền, được thử nghiệm dựa trên trên phương pháp Nagle và Harrd (1975)
Sử dụng hỗn hợp phản ứng (2,5 mL) chứa:
2,3 ml đệm natri axetat 0,01 M (pH= 6,0) (Merck, Đức) 0,05 mL Guaiacol 0,1% (v / v) (Fluka, Hoa Kỳ)
0,1 mL H2O2 0,1% (v / v) (Thuốc thử Carlo Erba, Ý) 0,05 mL của enzyme thô.
45
Ủ trong 5 phút ở 30℃ và độ hấp thụ được đo ở 470 nm Mẫu blank gồm có:
2,3 ml đệm natri axetat 0,01 M (pH= 6,0) (Merck, Đức) 0,05 mL guaiacol 0,1% (v / v) (Fluka, Hoa Kỳ)
0,1 mL H2O2 0,1% (v / v) (Thuốc thử Carlo Erba, Ý)
Kết quả:
Hoạt độ enzyme được tính theo công thức: A = 1000.∆𝐴𝑏𝑠 𝑉.∆𝑡 Trong đó:
∆𝐴𝑏𝑠 là kết quả đo độ hấp phụ OD ∆𝑡 là thời gian phản ứng (5 phút)
V là thể tích hỗn hợp phản ứng (2,5 ml)
2.2.3.4. Xác định hoạt độ enzyme Alliinase -/ Xác định enzyme alliinase:
Tỏi được cân chính xác trong khoảng từ 2 – 5g, sau đó được nghiền trong dung dịch đệm phosphate A (60 mmol/L, pH 7,0) chứa 10% (v/v) glycerol, 5% (w/v) NaCl và 5 mmol /L EDTA trong máy xay sinh tố, nhằm giữ cho enzyme không tham gia phản ứng enzyme với cơ chất sẵn có trong tỏi. Sau đó được định mức đến 50ml bằng đệm A và lọc qua giấy lọc rồi pha loãng 100 lần. Hàm lượng và hoạt tính của enzyme alliinase được xác định từ dịch lọc đã được pha loãng 100 lần.
Hoạt động alliinase được thể hiện khi hình thành pyruvate. Từ dịch tỏi đã pha loãng 100 lần, lấy 0.5ml dịch tỏi vào 1ml dung dịch đệm phosphate C (pH = 6.5, 60mmol/ L) chứa 25 µmol /L PLP (pyridoxal phosphate) và được bổ sung thêm 20 mmol/L alliin (tạo điều kiện phản ứng dư cơ chất).
Phản ứng enzym được để ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 5 phút. Phản ứng được kết thúc bằng cách thêm 1,5mL axit trichloroacetic 10% (v/v).
Phản ứng màu xác định pyruvate bắt đầu bằng việc thêm 0,5 mL 0,1% 2,4 dinitrophenylhydrazin (DNPH) vào và để trong 5 phút. Sau đó thêm 5 mL NaOH 0,5 mol /L tiếp tục để trong 10 phút, cuối cùng đo độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm bằng máy đo quang. Nồng độ pyruvate được tính theo đường chuẩn của pyruvate.
46
Một đơn vị hoạt độ của alliinase được xác định là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 µmol pyruvate trong 1 phút.
-/ Xây dựng đường chuẩn:
Sử dụng natri pyruvate làm chất chuẩn, với dãy nồng độ natri pyruvate tăng dần từ 0; 0.1; 0.15; …; 0.35 µmol/ml được tiến hành giống với quy trình được mô tả bên trên, xây dựng đường chuẩn liên hệ giữa nồng độ natri pyruvate và mật độ quang tại bước sóng 520 (OD 520)
Đường chuẩn thu được có dạng: y = 1.0335x + 0.106 với R2 = 0.9981 Trong đó: y là giá trị mật độ quang tại bước sóng 520nm
x là nồng độ natri pyruvate, µmol pyruvate/ml
-/ Kết quả:
Hàm lượng natri pyruvate tạo thành trong thời gian 1 phút từ 1g chất khô của mẫu phân tích được tính theo công thức:
X = (𝑌−0.106).50.100
1,0335 .𝑉.𝑚.(1−𝑤).5 (µmol pyruvate/g chất khô) Trong đó:
Y - giá trị mật độ quang 100 – hệ số pha loãng 50 - thể tích định mức, ml 5 – thời gian phản ứng, phút
V – thể tích mẫu đem phân tích, ml (V = 0.5ml) w – độ ẩm mẫu phân tích (0 < w < 1)
47
Bảng 2.2. b: So sánh các phương pháp xác định hoạt lực enzyme Alliinase
Phương pháp của Schwimmer và cs. (1961) Phương pháp HPLC Nguyên
tắc
Sử dụng dung dịch màu DNPH sau đó đo độ hấp phụ bằng máy đo quang → xác định thông qua hàm lượng pyruvate
Mang dung dịch lọc đi chạy máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC → xác định lượng acide pyruvic tạo thành
Thiết bị Thiết bị phòng thí nghiệm dùng trong phân tích
Thiết bị HPLC: 1 máy bơm nhị phân, 1 máy dò dãy diode, một hệ thống phần mềm, một bộ lấy mẫu tự động, một cột X-terra MS C18, Nguyên lý hoạt động
X Pha động: 2% acide acetic trong nước (A), 2% acide acetic trong acetonitrile (B)
Hóa chất, thí
nghiệm
-/ Dung dịch đệm phosphate A (60 mmol/L, pH 7,0) chứa 10% (v/v) glycerol, 5% (w/v) NaCl và 5 mmol /L EDTA trong máy xay sinh tố, nhằm giữ cho enzyme không tham gia phản ứng enzyme với cơ chất sẵn có trong tỏi
-/ Lấy 0.5ml dịch tỏi vào 1ml dung dịch đệm phosphate C (pH = 6.5, 60mmol/ L) chứa 25 µmol /L PLP (pyridoxal phosphate) và được bổ sung thêm 20 mmol/L alliin (tạo điều kiện phản ứng dư cơ chất).
-/ Phản ứng enzyme được kết thúc bằng cách thêm 1,5mL axit trichloroacetic 10%
-/ Phản ứng màu xác định pyruvate bắt đầu bằng việc thêm 0,5 mL 0,1% 2,4
dinitrophenylhydrazin (DNPH) vào và để trong 5 phút. Sau đó thêm 5 mL NaOH 0,5 mol /L tiếp tục để trong 10 phút
-/ Nước cất để nghiền, thu dịch lọc enzyme thô
-/ Metanol, acetonitrile, nước cất dùng cho thiết bị HPLC -/ Sicagel cho sắc ký cột sicagel, Sephadex cho sắc ký cột Sephadex
-/ Dung môi lọc: chloroform, aceton, methanol
Giá thành
X Chi phí cho hệ thống thiết bị HPLC tương đối cao.
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
-/ Các số liệu qua các phương pháp phân tích được lưu và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel và phần mềm sử lý thống kê số liệu SPSS.
48
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của chế độ bảo quản đến chỉ tiêu chất lượng của tỏi
3.1.1. Khảo sát một số chỉ tiêu lý hóa của tỏi nguyên liệu
Tỏi sau khi thu hái vận chuyển về phòng thí nghiệm, phân loại và đánh giá một số chỉ tiêu hóa lý. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1.1.
Bảng 3.1. a: Một số chỉ tiêu hóa lý của tỏi nguyên liệu