IV. Nội dung nghiên cứu
2.3.Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lý thuyết
Thu thập thông tin khoa học trên cơ sở nghiên cứu tài liệu đã có và bằng các thao tác tư duy logic để rút ra kết luận khoa học cần thiết
2.3.2. Phương pháp chiết dịch nghiên cứu
Cây An xoa sau khi được thu hái tại thành phố Đà Nẵng, được rửa sạch, phơi trong bóng râm đến khơ, xay nhỏ làm ngun liệu cho q trình thu chiết cao.
Cây An xoa được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt bằng ethanol. Dịch chiết sau khi ngấm kiệt được thu hồi dung môi bằng cô quay chân không với nhiệt độ 55ºC, áp suất 137atm để tạo cao chiết.
2.3.3. Phương pháp khảo sát sơ bộ các thành phần trong cao chiết:
Khảo sát sơ bộ các thành phần hóa học được áp dụng phương pháp của trường đại học Dược khoa Rumani có cải tiến phù hợp với phịng thí nghiệm. Ngun tắc của phương pháp là dựa vào độ hòa tan của các hợp chất trong dược liệu để tách các hợp chất bằng
16
dung mơi có độ phân cực khác nhau. Sau đó, xác định các hợp chất này bằng các phản ứng chuyên biệt [21].
Định tính alkaloid [47]
Cân 2g mẫu cao cho vào 20ml dung dịch acid sulfuric 5% trong ethanol 50%. - Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat, nếu thấy xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì phản ứng dương tính.
- Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Dragendoff, nếu thấy xuất hiện kết tủa da cam thì phản ứng dương tính.
Định tính anthraquinol [47]
- Phản ứng của Borntrager: cân 0,5g mẫu cao cho vào ống nghiệm cùng 5ml chloroform và lắc trong 5 phút. Sau khi lắc thêm vào khoảng 5ml dung dịch amoniac 10% và lắc nhẹ. Nếu thấy màu hồng, đỏ hoặc tím chứng tỏ trong mẫu có sự xuất hiện của anthraquinol .
- Phản ứng của Borntrager (đối với dẫn xuất của anthracen): cân 1g mẫu đun sôi với 5ml axit clohydric 10% trong 3 phút. Lọc và để nguội dung dịch, sau đó thêm 5ml benzen. Lớp benzen được lấy ra và thêm vào khoảng 5ml amoni hydroxit 10%. Nếu thấy xuất hiện màu hồng hoặc đỏ anh đào chứng tỏ trong mẫu có sự xuất hiện của anthraquinol.
Định tính plavanoid [47]
Cân 2 g mẫu cao hòa tan trong 10ml nước cất rồi hút 3ml hỗn hợp vào trong 2 ống nghiệm. Phương pháp này gồm thử nghiệm với dung dịch NaOH 10% và thử nghiệm với FeCl3.
- Thử nghiệm NaOH 10%: thêm 2ml dung dịch NaOH 10% vào 3ml hỗn hợp rồi lắc đều. Nếu thấy xuất hiện dung dịch màu vàng rồi chuyển sang không màu nếu cho acid hydrochloric vào chứng tỏ có sự hiện diện của islavonoids trong mẫu cao.
- Thử nghiệm FeCl3: nhỏ 3 giọt dung dịch FeCl3 5% vào 3ml hỗn hợp rồi lắc đều. Sự chuyển màu của dung dịch sang màu xanh đen chứng tỏ có tồn tại flavonoids trong mẫu cao.
Định tính steroid và triterpenoid [47]
- Phản ứng của Salwoski: nhỏ 2 đến 3 giọt axit sulfuric để tạo thành 2 lớp, nếu xuất hiện màu nâu đỏ ở giữa chứng tỏ sự hiện diện của vòng steroid.
17
- Phản ứng mở đóng vịng lacton: cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch chiết; ống 1: thêm 0,5ml NaOH 10%; ống 2: để nguyên. Đun cả 2 ống trong 2 phút, để nguội, nếu thấy hiện tượng: ống 1: có tủa đục màu vàng; ống 2: trong suốt. Thêm từ từ nước cất vào cả 2 ống đến 4ml, nếu thấy ống 1: trong suốt và ống 2: có tủa đục, thêm vài giọt HCl đặc vào ống 1, ống 1 trở lại đục như ống 2 thì phản ứng dương tính.
Định tính saponin [47]:
- Quan sát hiện tượng tạo bọt: lấy 1ml dịch chiết thêm vào khoảng 5ml nước cất. Đun cách thủy 10 phút, lọc qua bông lấy dịch chiết vào ống nghiệm to. Thêm nước cất đến khoảng 10ml, bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát cột bọt thấy cột bọt bền sau 15 phút thì dương tính.
Định tính tannin [47]
Lấy 2g cao hòa tan trong 10ml dung dịch cồn 50% rồi chia làm 2 phần bằng nhau: - Thử nghiệm FeCl3: nhỏ 3 giọt dung dịch FeCl3 vào phần thứ nhất, màu sắc của mẫu chuyển sang màu xanh lam hoặc màu xanh đen đậm chứng tỏ mẫu có tồn tại tannin
- Thử nghiệm chì acetate: nhỏ 3 giọt dung dịch chì acetate vào phần thứ ba, lắc đều cho đến khi thấy xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt thì chứng tỏ có sự tồn tại của tannin trong mẫu cao
2.3.4. Phương pháp đánh giá hiệu quả chống oxy hóa trong ống nghiệm
Phương pháp đánh giá khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH là một phương pháp thường được sử dụng để xác định khả năng thu dọn gốc tự do. Phương pháp này đơn giản, nhanh chóng và ổn định vì vậy được sử dụng rộng rãi để sàng lọc các chất chống oxy hóa [14] [2]. DPPH là một gốc tự do có bước sóng cực đại hấp thu tại 517nm và có màu tím. Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt [2].
Phương pháp DPPH được tiến hành theo phương pháp của Yuvaraj và cô ̣ng sự (2013) [46] có chỉnh sửa: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Mẫu thử được pha stock trong DMSO ở nồng độ 2 mg/ml. Sau đó được pha thành dải nồng độ thử mẫu như sau: 200; 100; 50; 25; 12,5 µg/ml với nước cất khử ion.
- Acid ascorbic (đối chứng tham khảo) được pha thành dải nồng độ 200; 100; 50; 25; 12,5 µg/ml với nước cất khử ion.
- DPPH pha trong methanol (100%) nồng độ 0,25 µM.
- Hút 1ml mẫu nghiên cứu đã pha ở các nồng đô ̣ vào ống thủy tinh. Mỗi nồng độ thử chất được lặp lại 3 lần.
- Thêm 1ml dung dịch DPPH đã chuẩn bị ở trên vào các ớng đã có sẵn mẫu nghiên cứu.
18
- Ớng khơng có mẫu thử chỉ có 1ml nước và 1 ml DPPH làm đối chứng. - Ủ ở nhiệt đô ̣ phòng trong 30 phút.
- Xác định độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng tại bước sóng 517 nm trên máy đọc quang phổ
- Vì mẫu nghiên cứu và dung dịch DPPH được đưa vào ống theo tỷ lê ̣ 1:1, nên nồng độ mẫu nghiên cứu trong ống có DPPH sẽ giảm đi một nửa còn 100; 50; 25; 12,5; 6,25 µg/ml. Và nờng đơ ̣ Acid ascorbic (VitC) trong ống có DPPH sẽ giảm đi một nửa cịn 100; 50; 25; 12,5; 6,25 µg/ml.
- Giếng có dung mơi hòa mẫu nghiên cứu và dung dịch DPPH được xem là giếng đối chứng. Giếng có sử dụng Acid ascorbic (VitC) là chất đối chứng tham khảo.
Khả năng trung hịa gốc oxy hóa tự do (Scavenging Activities - SA) sinh ra từ DPPH của mẫu thử được tính theo cơng thức sau:
% SA = (ODđối chứng – ODmẫu thử)*100/ODđối chứng (%)
Trong đó: ODđối chứng : Độ hấp thụ tại giếng không chứa chất thử
ODmẫu thử : Độ hấp thụ tại giếng chứa chất thử
Giá trị IC50 (Inhibitory concentration at 50% - nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do DPPH) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve2Dv4.
19
2.3.5. Phương pháp đánh giá hiệu quả chống viêm trong ống nghiệm
Hoạt tính kháng viêm trong ống nghiệm được khảo sát dựa trên phương pháp của Priyanka C. và cộng sự [34]
- Pha 5ml hỗn hợp mẫu trong ống nghiệm. Hỗn hợp phản ứng gồm: 0,2 ml albumin trứng (từ trứng gà tươi); 2,8 ml dung dịch muối đệm phốt phát (PBS, pH 6,4) và 2 ml dịch nghiên cứu để nồng độ cuối cùng đạt giá trị 31,25 , 62,5, 125, 250, 500, 1000 µg/mL.
- Trong ống đối chứng, nước cất được thay thế dung dịch nghiên cứu
- Diclofenac natri được sử dụng làm thuốc tham chiếu và pha hỗn hợp mẫu sao cho nồng độ cuối cùng đạt giá trị 78.125, 156.25, 312.5, 625, 1250, 2500 µg / mL
- Ủ các hỗn hợp mẫu ở 37 ± 2 ° C trong tủ ấm BOD (Labline Technologies) trong thời gian15 phút và sau đó được làm nóng ở 70 ° C trong năm phút.
Đo độ hấp thụ của mẫu nghiên cứu khi mẫu trở về nhiệt độ phòng ở bước sóng 660nm (SHIMADZU, UV 1800)
Phần trăm ức chế biến tính protein được tính bằng cách sử dụng cơng thức sau:
% ức chế = 100 × [V t / V C - 1]
Trong đó: V t = độ hấp thụ của mẫu thử
V c = độ hấp thụ của mẫu đối chứng.
Nồng độ ức chế 50% (IC 50 ) được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve2Dv4.
2.3.6. Phương pháp xử lí số liệu
Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng cơng cụ phân tích số liệu (data analysis) của Microsoft excel. Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng (M ± SD) & (M ± SE). Đánh giá, so sánh giá trị trung bình giữa các lơ thí nghiệm bằng phương pháp thống kê sử dụng chuẩn t-Student. Sự khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
20
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN