Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.2. Một số đặc tính của vi khuẩn E.Coli nói chung và các chủng gây bện hở
2.2.5. Các yếu tố độc lực quan trọng và đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E.col
coli gây bệnh ở gia cầm
Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli là nhờ các yếu tố độc lực, gồm: i)
khả năng bám dính của vi khuẩn vào lớp niêm mạc nhờ các fimbriae; ii) khả năng xâm nhập nhờ các yếu tố xâm nhập (như khả năng kháng bổ thể trong huyết thanh, khả năng tồn tại và phát triển của vi khuẩn trong môi trường sinh lý của vật chủ nhờ hệ thống thu nhận, cạnh tranh sắt), khả năng sản sinh ra các tác động gây độc tế bào (Dho – Moulin & J.P Lafront, 1999).
2.2.5.1. Yếu tố bám dính (Fimbriae)
Yếu tố bám dính của vi khuẩn E. coli được định vị trên các fimbriae, đó là những chuỗi protein mạch thẳng, tập hợp từ những đơn vị độc lập, có thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử. Tổng số các đơn vị này trên chuỗi protein quyết định trọng lượng phân tử và độ dài của yếu tố bám dính. Lực tham gia liên kết các đơn vị này thành chuỗi protein cho đến nay vẫn chưa được làm sáng tỏ, tuy nhiên những mối liên kết này có thể bị tách ra trong mơi trường có Na2SO4 (Isaacson & cs., 1981).
Các đơn vị protein của fimbriae được tổng hợp phần lớn từ các amino axit và các hợp chất không phải là amino axit như photphat hoặc photpholipit. Các hợp chất khơng phải amino axit này có thể tham gia vào các liên kết bên trong các đơn vị hoặc chỉ tạo nên những điểm làm chức năng liên kết ở vỏ bọc bên ngồi có tính chất quyết định đối với chức năng bám dính. Trọng lượng phân tử của mỗi đơn vị bám dính từ 8.000 đến 26.000 dalton.
Cấu trúc của các fimbriae phần lớn được cấu tạo bởi các axit amin không phân cực (chiếm khoảng 50%) trong số các axit amin.
Các nhà khoa học đã chứng minh được fimbriae của E. coli tạo liên kết hydro vững chắc hơn nhiều so với E. coli khơng có fimbriae, đồng thời tìm ra độ dài tổng số của cấu trúc thẳng của fimbriae, mối liên quan của chúng đối với đường D – Mannose, cũng như khả năng ngăn cản sự bám dính của các loại vi khuẩn này lên trên tế bào hình cầu chuột lang khi có mặt đường D – Mannose. Các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng đó là của fimbriae typ 1, từ đó đã đưa ra những nhận xét như sau:
+ Vị trí liên kết dành cho fimbriae của E. coli được tìm thấy trong dạng cấu trúc hình oval.
+ Trong một số trường hợp, khi có mặt đường D – Mannose thì đường sẽ phá vỡ hay ngăn cản sự ngưng kết của hồng cầu với các yếu tố bám dính của vi khuẩn E. coli do điểm tiếp nhận của yếu tố bám dính cũng có bản chất là Mannose (Mannosides).
+ Vị trí liên kết dành cho fimbriae của vi khuẩn E. coli là tương tự như vị trí dành cho liên kết của vi khuẩn Klebsiella pneumoniae, nhưng khác với vị trí liên kết dành cho fimbriae của vi khuẩn Salmonella typhimurium.
+ Ba yếu tố tạo nên sự bám dính được sắp xếp bởi các hợp chất cấu trúc nên các đơn vị Nitơ – Glucozit và các đơn vị này có mặt trên bề mặt của tế bào ruột non.
* Fimbriae F1 (type1)
Fimbriae F1 có cấu trúc là các sợi protein dài, có bề mặt giống như sợi chỉ, đường kính khoảng 7nm, dài khoảng 0,1 – 2,0µm (Krogfelt and Klemm, 1988), gồm một protein chính (FimA) (khoảng 17 kDa) và một số thành phần phụ được sắp xếp bao xung quanh trục chính là FimF, FimG và FimH. Các thành phần này được mã hóa bởi các gen Fim, nằm ở vị trí 98nm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn
E. coli và gồm 9 gen, trong đó 7 gen nằm trên cùng một operon và khả năng bộc
lộ của chứng được kiểm soát bằng một yếu tố đảo ngược có chứa chất hoạt hóa (Orndoff, 1994).
* Fimbriae P
Fimbriae được phát hiện lần đầu tiên ở các chủng E. coli gây bệnh nhiễm trùng đường niệu trên của người và là yếu tố độc lực quan trọng gây ra viêm thận và bể thận (Kallenius & cs., 1981). Fimbriae P được mã hóa bởi các nhóm gen Pap nằm trên nhiễm sắc thể, gồm 11 gen mà cấu trúc và chức năng của chúng đã có rất nhiều cơng trình nghiên cứu (Hacker, 1992).
- Fimbriae dạng xoắn (Curli fimbriae)
Fimbriae dạng xoắn có cấu trúc gồm nhiều sợi nhỏ, mảnh, cuộn lại với nhau, có đường kính khoảng 2nm, được tìm thấy trên bề mặt của vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. (Dho – Moulin & T.P Lafont, 1999). Cấu trúc này giúp cho vi
khuẩn bám dính vào các thể ngoại bào và các protein của huyết thanh như fibronectin, laminin, plasminogen và protein kích hoạt plasminogen.
Vai trị của các fimbriae dạng xoắn trong quá trình sinh bệnh học vẫn chưa được biết đến một cách đầy đủ. Tuy nhiên, những đặc trưng nhất định của fimbriae dạng xoắn như khả năng gắn vào các tế bào của động vật có xương sống cấp cao hoặc khả năng gắn vào các thể ngoại bào và protein của huyết thanh (Olsen & cs, 1989) cũng phần nào góp phần vào sự bám dính của vi khuẩn trong giai đoạn đầu của quá trình nhiễm bệnh.
* Một số loại fimbriae khác như AC/1 fimbriae (Avian E. coli 1) hoặc fimbriae gần giống loại F1 (type 1 –like fimbriae (La Ragione và Woodward, 2002), có vai trị quan trọng trong sự bám dính của vi khuẩn vào các tế bào biểu mô gia cầm trong điều kiện in vitro và in vivo.
2.2.5.2. Các yếu tố xâm nhập của vi khuẩn E. coli
Khả năng xâm nhập của vi khuẩn là khả năng của vi khuẩn E. coli qua được hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy trên bề mặt niêm mạc để xâm nhập vào tế bào biểu mơ (epitel) hoặc vào máu, từ đó sinh sản và phát triển, trong khi đó, những vi khuẩn khác khơng có khả năng xâm nhập thì sẽ khơng thể qua được hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy hoặc khi qua được lớp hàng rào này sẽ bị tiêu diệt bởi các tế bào đại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc.
Bình thường, túi khí của gia cầm khơng có cơ chế phịng vệ tại chỗ, chủ yếu dựa vào sự kích hoạt các bạch cầu trung tính mới, sau đó là nhờ q trình thực bào. Các thí nghiệm trong điều kiện in vivo cho thấy các chủng APEC có khả năng sống sót qua q trình thực bào (Pourbakhsh & cs., 1997a, Mellata và Dho – Moulin, 2003). Các nhà khoa học đưa ra giả thuyết về khả năng xâm nhập thông qua các mạch bạch huyết của phổi, do vậy vi khuẩn đã có mặt rất nhiều trong máu.
Nhìn chung, khả năng xâm nhập của vi khuẩn E. coli có sự tham gia của một số yếu tố nhất định sau:
* Kháng nguyên vỏ bọc K1 (K1 capsule)
Phần lớn các chủng E. coli gây bệnh cho gia cầm thuộc về một số nhóm kháng nguyên O, K nhất định, trong các nhóm kháng nguyên O phổ biến nhất là O1, O2 và O78 và nhóm kháng nguyên K, trong nhóm kháng nguyên K phổ biến nhất là K1 và K80. Kháng nguyên K1 cũng có liên quan đến các nhiễm trùng ngoài đường ruột ở người, có đặc tính kháng bổ thể và tính kháng ngun kém. Bree và cs (1989) chứng minh được những kháng nguyên K1 thường xuất hiện ở các nhóm O1 và O2 và là yếu tố độc lực quan trọng ở các chủng gây bệnh cho gia cầm, đặc biệt là nhóm O2.
Kháng nguyên K1 có bản chất là polysaccharide. Gần đây nhất, Pourbakhsh và cs (1997b) đã công bố kết quả nghiên cứu về 3 chủng APEC mang kháng nguyên K1 có sức đề kháng tốt nhất với tác dụng kháng khuẩn của bổ thể trong huyết thanh so với 3 chủng APEC mang các kháng nguyên K khác.
* Hệ thống cạnh tranh và thu nhận sắt
Sắt là yếu tố cần thiết cho hoạt động trao đổi chất và các quá trình sinh học khác của hầu hết các vi sinh vật (Andrew & cs, 2003). Trong số các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli gây bệnh trên gia cầm, khả năng cạnh tranh sắt được
xem là yếu tố độc lực quan trọng, giúp vi khuẩn tồn tại, phát triển trong máu, sau đó theo máu đi đến các khí quan gây biến đổi bệnh lý nghiêm trọng (Dho – Moulin và T.P Lafront, 1999). Để tồn tại và phát triển trong máu, vi khuẩn phải có hệ thống tiếp nhận sắt đặc biệt. Vi khuẩn sẽ giải phóng ra mơi trường chất siderophore, đây là một chất có trọng lượng phân tử lớn và có ái lực rất lớn đối với ion sắt ở dạng phức hợp (Fe –chelator). Các chủng E. coli gây bệnh cho gia cầm (APEC) có thể sử dụng tất cả các loại siderophore do chúng tự giải phóng (Andrew và cs, 2003). Các siderophore này được nhận biết bởi yếu tố cảm thụ sắt chuyên biệt có trên màng tế bào vi khuẩn và vận chuyển thụ động vào bên trong tế bào nhờ năng lượng của hệ thống TonB – ExbB-ExbD. Khi vào đến tế bào chất, phức hợp Fe-chelator/siderophore bị oxy hóa và giải phóng Fe++ cho các hoạt động của tế bào vi khuẩn (Dho – Moulin & T.P Lafront, 1999).
Hệ thống cạnh tranh sắt thường có liên quan đến các chủng E. coli gây bệnh ngồi đường tiêu hóa của người và động vật. Theo Dozois và cs (1992), hệ thống cạnh tranh sắt là rất quan trọng đối với độc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli
gây nhiễm trùng huyết ở gà và gà tây.
Dho - Moulin và Lafont (1999) quan sát thấy mối quan hệ tỷ lệ thuận giữa khả năng của các chủng E. coli gia cầm phát triển trong môi trường ion sắt bị giới hạn trong điều kiện in vitro với tỷ lệ chết của gà con 1 ngày tuổi. Sau đó, các nhà khoa học chứng minh đó là do hệ thống cạnh tranh sắt. Rất nhiều nghiên cứu đã xác nhận: Phần lớn các chủng APEC (73-98%) có mang, biểu hiện hệ thống cạnh tranh và thu nhận sắt, trong khi đó các chủng khơng có độc lực thì ít có khả năng này hơn (Dozois và cs, 1992). Mối liên quan chặt chẽ giữa sự có mặt của hệ thống cạnh tranh sắt và độc lực của các chủng APEC đã được các nhà khoa học sử dụng như một cơng cụ chẩn đốn dựa trên việc xác định đặc tính miễn dịch của protein IutA – là yếu tố cảm thụ cho sự thu nhận sắt.
Rất nhiều nghiên cứu cho thấy phần lớn các chủng APEC có mang hệ thống thu nhận sắt để thu nạp các ion sắt trong mơi trường có nồng độ sắt thấp của cơ thể vật chủ. Linggood và cs (1987) xác định được hệ thống thu nhận sắt trong 89% của 61 chủng E. coli gây bệnh bại huyết gia cầm được kiểm tra, so với 11% trong số 27 chủng phân lập từ gà khỏe. Tương tự, Emery và cs (1992) khi kiểm tra 420 chủng phân lập được từ gà tây và 80 chủng từ gà bị bại huyết, thu được 74% số chủng từ gà và 80% từ gà tây có hệ thống thu nhận sắt. Dozois và cs (1992) cho biết: có tới 98% các chủng E. coli từ gà và 73% từ gà tây bị bại huyết có đặc tính thu nhận sắt.
* Đặc tính kháng bổ thể trong huyết thanh
Đặc tính kháng bổ thể trong huyết thanh được quyết định bởi các cấu trúc bề mặt của vi khuẩn như giáp mô, lipopolysaccharide, khả năng sản sinh ColV và các porotein ngồi màng, thường có liên quan chặt chẽ với các chủng APEC, đặc biệt là các chủng phân lập được từ gia cầm bị bại huyết. Ellis và cs (1988) xác định được khả năng kháng bổ thể trong huyết thanh của 25 chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ gà tây và tính độc của chúng đối với gà tây 3 tuần tuổi. Trong một nghiên cứu khác với 40 chủng E. coli phân lập từ đường ruột của gà khỏe và 40 chủng từ gà bị bại huyết. Nolan và cs (2003) chứng minh đặc tính kháng bổ thể có liên quan chặt chẽ tới khả năng gây chết gà và ít có liên quan hơn với khả năng gây chết phôi.
Hai gen Iss và traT được xác định là có liên quan trực tiếp đến khả năng kháng bổ thể trong huyết thanh của vi khuẩn E. coli. Do tác động của ngoại cảnh, đặc tính kháng bổ thể trong huyết thanh có mặt ở hầu hết các chủng nhưng khơng phải tất cả chúng đều mang các gen Iss và traT, mà cịn rất nhiều yếu tố khác góp phần tạo nên. Thực tế, kháng bổ thể trong huyết thanh là một khái niệm đa chiều, ngoại trừ các kháng nguyên bề mặt là sản phẩm của các gen như Iss và traT, các yếu tố khác cũng đóng vai trò quan trọng, như sự có mặt của các lipopolysaccharide vỏ bọc hoặc kháng nguyên O. Cho đến nay, các cơng trình nghiên cứu vẫn chưa xác định được rõ bản thân gen Iss là một yếu tố độc lực hay chỉ đơn thuần đánh dấu sự có mặt của các thành phần độc lực lớn hơn. Trong một nghiên cứu gần đây với 80 chủng E. coli
phân lập từ gà khỏe và gà mắc Colibacillosis, Vandekerchove và cs (2005) phát hiện ra tổ hợp các gen Tsh, Iss, iucA, iutA và CvaC phổ biến ở các chủng từ ổ dịch, hơn là các chủng từ gà đối chứng.
* Yếu tố kháng khuẩn do Colicin V (ColV)
Tên gọi colicin được Gratia mô tả lần đầu tiên năm 1925 tại Bỉ, sau đó Gratia và Frederiq mô tả vào năm 1946 để chỉ một loại chất gần giống chất kháng sinh, được tạo ra bởi các chủng E. coli, nhưng khác với các chất kháng
sinh ở chỗ chỉ có tác dụng đối với các chủng cùng lồi hoặc có quan hệ gần. Colicin là một protein, có trọng lượng 40-60 KDa, do các gen trên plasmid mã hóa và được giải phóng ngoại bào. Fernandez-Beros và cs (1990) chứng minh được gen mã hóa các ColV chủ yếu nằm trên các plasmid đối với các chủng gây bại huyết, nằm trên các nhiễm sắc thể đối với các chủng gây tiêu chảy.
Một số nghiên cứu đã chứng minh các chủng vi khuẩn mang plasmid ColV có khả năng sống sót trong máu và dịch ngoại vi cao hơn so với các chủng khơng có ColV (Davies & cs., 1981). Việc loại bỏ plasmid ColV khỏi các chủng E. coli có độc lực ln kèm theo sự giảm độc lực, khi đưa plasmid ColV trở lại thì độc lực của chúng được khôi phục lại như ban đầu.
Blanco và cs (1998) xác định được 22% các chủng E. coli gây bại huyết ở gà có khả năng sản sinh ra ColV so với 7% các chủng có nguồn gốc từ phân gia cầm khỏe. Nghiên cứu của McPeake và cs (2005) cho kết quả cao hơn, 99,1% các chủng từ gia cầm bệnh và 82,2% từ gia cầm khỏe có mang gen CvaC mã hóa cho sự tổng hợp ColV.
Để mô tả đặc điểm độc lực của các dòng E. coli gây bệnh đường ruột của gà ở Bắc Algeria, Mellata và cs (2003) xác định tỷ lệ các chủng có khả năng kháng bổ thể trong huyết thanh là 46%, sản sinh aerobactin là 12% và 38% các chủng có khả năng sản sinh ColV. Thực tế, có thể mã hóa kiểu hình bởi các gen nằm trên cùng một plasmid có tên là pColV (Mellata & cs., 2003).
* Yếu tố dung huyết (Hly)
E. coli có khả năng sản sinh ra ít nhất bốn yếu tố gây dung huyết (haemolysin) được xác định bởi kiểu dung huyết mà chúng tạo ra. Các nghiên cứu của Smith và cs (1976) xác định yếu tố dung huyết α (α- haemolysin) là một yếu tố khơng chịu nhiệt, có thể qua lọc và được chiết xuất ngoại bào, đơi khi được mã hóa trên plasmid (đối với các chủng E. coli có nguồn gốc từ lợn); cịn yếu tố dung huyết β (β-haemolysin) là yếu tố gắn liền với tế bào vi khuẩn, không thể qua lọc và chưa được xác định đặc tính một cách rõ ràng. Cả hai loại này đều tạo ra một vùng dung huyết rõ ràng và có thể phân biệt được trên môi trường thạch máu.
Smith và Walton (1976) mô tả một loại yếu tố dung huyết nữa là δ- haemolysin, có thể gây dung huyết hồng cầu ngựa, hồng cầu chuột lang và hồng cầu cừu, nhưng khác với enterohaemolysin ở chỗ khơng có khả năng dung giải hồng cầu người và thỏ.
Đã có nhiều nghiên cứu về bản chất của yếu tố dung huyết và cơ sở di truyền của chúng, nhưng vai trò của yếu tố dung huyết trong cơ chế sinh bệnh của vi khuẩn E. coli vẫn chưa được biết đến một cách rõ ràng. Tuy nhiên, các nhà khoa học đều đi đến ý kiến thống nhất: bản thân yếu tố dung huyết là một loại
độc tố của vi khuẩn vì các vi khuẩn mang đặc tính đó có khả năng dung giải hồng cầu và lấy sắt từ các nhóm HEM để cung cấp nguyên liệu cần thiết cho quá trình phát triển. Ngồi khả năng lấy sắt từ các protein có gắn với sắt, một số loại vi