Ở Việt Nam, các nhà chọn giống thường sử dụng phương pháp truyền thống để cải tiến khả năng kháng bệnh bạc lá ở lúa, nhưng kết quả chưa cao, các dòng/giống mang gen kháng chưa ổn định hoặc chưa kháng được phổ rộng. Mười năm trở lại đây, với sự phát triển nhanh chóng của các chỉ thị phân tử, các nhà nghiên cứu của Việt Nam đã bước đầu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống: Nguyễn Thị Pha & Nguyễn Thị Lang (2004) đã sử dụng các chỉ thị STS (RG556, RG136, pTA248), SSR (RM21, RM114, RM122, RM164, RM190) để phát hiện các gen xa5, xa13 và Xa21 trên các giống lúa địa phương bố, mẹ và con lai. Vũ Hồng Quảng (2011) đã thành công sử dụng các chỉ thị RM5509 và pTA248 để phát hiện gen kháng bệnh bạc lá Xa7, Xa21 ở các dòng bố mẹ 9311BB, D42BB, R308BB. Kết quả kiểm tra cho thấy: Dòng bố R308BB có 90% số cá thể của mang gen kháng Xa21 đồng hợp tử, 10% số cá thể mang gen dị hợp tử; dòng bố D42BB có 10% số cá thể mang gen kháng dị hợp tử, dòng bố 9311BB có 100% số cá thể mang gen Xa7 và tất cả các cá thể này đều đồng hợp tử về gen Xa7.
Tác giả Võ Thị Minh Tuyển (2012) đã thành công khi ứng dụng chỉ thị phân tử và nuôi cấy bao phấn trong lai tạo để tạo ra các nguồn vật liệu mang gen kháng bệnh bạc lá. Kết quả đã tạo ra được 1 giống lúa mới DT45 (mang gen xa5) được công nhận sản xuất thử, 1 giống DT47 (mang gen Xa7) khảo nghiệm Quốc gia. Tác giả cũng xác định được dòng IRBB62 mang nhiều gen kháng bệnh bạc lá làm vật liệu cho gen trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử mang lại hiệu quả cao (tiết kiệm thời
16
gian và xác định chính xác dòng mang nhiều gen kháng bệnh) hơn sử dụng dòng NILs mang đơn gen kháng.
Tác giả Nguyễn Thị Hồng Tươi & cs (2015) đã tiến hành lai tạo và chọn lọc đã xác định dòng TĐ1, TĐ2 và TĐ4 mang hai gen kháng bệnh bạc lá (Xa7 và Xa21), có hàm lượng anthocyanin cao và hàm lượng amylose thấp, riêng dòng TĐ4 không những kháng được bệnh bạc lá mà còn có khả năng quang hợp cao; các dòng tẻ cẩm mới chọn tạo đáp ứng được các yêu cầu để phát triển thành giống tẻ cẩm mới kháng bệnh bạc lá.
Nguyễn Văn Giang (2015) đã chọn tạo thành công 03 giống lúa nếp chất lượng, kháng bệnh bạc lá NV2, NV3 và NV4 bằng kĩ thuật chọn giống nhờ chỉ thị phân tử . Tác giả Võ Thị Minh Tuyển & cs (2015) đã thành công trong việc lai chuyển đồng thời 2-3 gen kháng bệnh bạc lá (Xa4, Xa7 và Xa21) vào giống BT7 và một số giống lúa ưu tú khác. Dòng BT62.1 được tạo ra từ tổ hợp lai Bắc thơm số 7/IRBB62 mang 2 gen kháng bệnh bạc lá Xa7 và Xa21, có thời gian sinh trưởng thuộc nhóm ngắn ngày nhưng có năng suất thấp đã được cải tiến nhờ đột biến tia gamma. Kết quả đã thu nhận được 8 dòng triển vọng ở thế hệ M5 có thời gian sinh trưởng ngắn, chất lượng tốt và kháng bệnh bạc lá giống như dòng gốc nhưng lại có năng suất cao hơn, đạc biệt có 2 dòng M23 và M24 có năng suất cao trên 7 tấn/ha.
Dương Xuân Tú (2015) đã tiến hành lai tạo 20 tổ hơp lai 20 tổ hợp lai đơn, 3 tổ hợp lai kép và 4 tổ hợp lai backcross để tạo nguồn vật liệu mới từ nguồn vật liệu khởi đầu. Kết quả đã chọn tạo được 15 dòng lúa thơm mới, mang 1 - 2 gen kháng bệnh bạc lá (trong các gen Xa4, xa5 và Xa7), thể hiện kháng tốt với các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá phổ biến ở các tỉnh phía Bắc. Cùng với đó tác giả và nhóm cộng sự đã nghiên cứu lựa chọn chỉ thị phân tử DNA liên kết với gen mùi thơm và gen kháng bệnh bạc lá ứng dụng trong chọn tạo giống lúa thơm kháng bệnh bạc lá ở các tỉnh phía Bắc, kết quả đã xác định được chỉ thị Npb181, RG556 và P3 phát hiện gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5 và Xa7 kháng với vi khuẩn gây bệnh bạc lá ở các tỉnh phía Bắc với độ chính xác lần lượt là 96%, 93% và 97%. Kết quả của việc sử dụng phương pháp chọn tạo giống bằng đánh giá kiểu hình kết hợp với chỉ thị phân tử chọn kiểu gen mục tiêu đã đưa ra được giống lúa thơm HDT10 thích hợp cho gieo trồng trong vụ xuân và vụ mùa tại các tỉnh phía Bắc, đáp ứng mục tiêu chọn tạo như thời gian sinh trưởng ngắn (105 ngày trong vụ mùa), năng suất từ 6,0 - 6,5 tấn/ha, thể hiện tính kháng với bệnh
17
bạc lá. Qua khảo nghiệm quốc gia tại các tỉnh phía Bắc, giống lúa HDT10 đã được đánh giá cao, có triển vọng để phát triển sản xuất tại các tỉnh phía Bắc trong thời gian tới.
Nhóm tác giả Dương Đức Huy & Nguyễn Văn Hoan (2016), đã tiến hành lai chuyển gen Xa7 từ dòng IRBB7 vào dòng phục hồi R212, là dòng bố của giống lúa lai LC212 bằng phương pháp lai trở lại. Bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo và chọn lọc nền di truyền sử dụng chỉ thị phân tử (MAS) đã tạo được 25 dòng R212 ở thế hệ BC2F4 và 8 dòng BC3F3 có kiểu hình tương tự R212, đồng hợp tử gen Xa7 và kháng cao với 3 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá. Đây là nguồn vật liệu ban đầu để tiếp tục chọn lọc ở giai đoạn tiếp theo nhằm chọn được dòng R212 mang gen kháng vi khuẩn gây bệnh bạc lá làm dòng bố cải tiến giống lúa LC212.
Năm 2018, đã lai tạo thành công nhờ sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử, tạo ra được 05 dòng triển vọng ở thế hệ BC3F3 (có nguồn gốc từ tổ hợp lai LT2/IRBB21) mang gen Xa21 biểu hiện tính kháng với 2 chủng vi khuẩn 981.HUA10146 và 996.HUA10 147. Các dòng này chính là nguồn vật liệu hữu ích và có thể phát triển thành giống thương mại.
Các dòng triển vọng hiện đang được trồng khảo nghiệm ở một số vùng thuộc đồng bằng sông Hồng để đánh giá khả năng kháng thực tế trong điều kiện tự nhiên. Tuy nhiên, thực tế cho thấy, việc sử dụng các dòng NILs của Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) làm dòng cho QTL/gen kháng có hiệu quả chưa cao do các chủng nòi sinh thái ở Việt Nam rất đa dạng và phong phú. Mặt khác, hiệu lực của các gen kháng bệnh bạc lá đối với các nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá phân lập ở các vùng khác nhau là không giống nhau - một gen có thể kháng với nòi ở vùng này nhưng lại nhiễm với nòi ở vùng khác. Chính vì vậy, hiện nay việc sử dụng và khai thác nguồn gen kháng địa phương đang được chú trọng và là giải pháp hữu hiệu trong công tác chọn tạo giống lúa kháng bền vững với bệnh bạc lá.
18
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Tiến hành các thí nghiệm về sinh học phân tử tại Bộ môn Đột biến và Ưu thế lai, Viện Di truyền Nông Nghiệp.
- Đánh giá đặc điểm nông sinh học các dòng lúa và lây nhiễm nhân tạo: tại ruộng thí nghiệm của bộ môn: Yên Sở - Hoài Đức – Hà Nội
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU: Từ tháng 1/2019 đến tháng 11/2019
3.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Các dòng lúa chọn tạo được từ tổ hợp lai, thế hệ BC3F1 và BC3F2 của tổ hợp lai TBR225/ IRBB64 (Các cá thể BC3F1 được ký hiệu TBR-1 đến TBR-19. Các cá thể BC3F2 được ký hiệu từ A1 đến A30)
- Dòng IRBB64 chứa gen kháng bạc lá Xa4, xa5, Xa7, Xa21 nhập nội từ Viện nghiên cứu Lúa Quốc tế IRRI.
- Giống lúa TBR225 của công ty giống cây trồng Thái Bình gốc làm đối chứng - IR24 nhập nội từ Viện nghiên cứu Lúa Quốc tế, là dòng chuẩn nhiễm - Các dòng đơn gen kháng: IRBB4 (mang gen kháng Xa4), IRBB7 (mang gen kháng Xa7), IRBB5 (mang gen kháng xa5), IRBB21 (mang gen kháng Xa21).
- Các chỉ thị phân tử liên kết với các gen kháng (Khoảng cách ≤ 5cM)
TT Tên mồi Trình tự NST Kích thước
Băng (bp) Gen kháng 1 RM6320 F: GAGCTGGACCTCCTCGACAC R: CATGCATCACCGAATGAGTC 5 164 xa5 2 P3 F: CAGGAATTGACTGGAGTAGTGGTT R: CATCACGGTCACCGCCATAT 6 275 Xa7
3 pTA 248 F: AGACGCGGAAGGGTGGTTCCCGGA R: AGACCGGTAATCGAAAGATGAAA 11 1300 Xa21
4 MP1-2 F: ATCGATCGATCTTCACGAGG R: CTGCTATAAAAGGCATTCGGGGTAT 11 45 Xa4
- Sử dụng 3 chủng vi khuẩn của Bộ môn Bệnh học phân tử đươc phân lập năm 2016
+ Chủng 1: Thu thập tại Tĩnh gia, Thanh Hóa; giống lấy mẫu bệnh: HT1 + Chủng 2: Thu thập tại Hải Dương; giống lấy mẫu bệnh: TBR225
+ Chủng 3: (Chủng có độc tính mạnh nhất): Địa điểm thu mẫu tại Nam Định, giống lấy mẫu bệnh: BT7).
19
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1 Đánh giá và chọn cá thể BC3F1 mang gen kháng bằng chỉ thị phân tử
Sản phẩm PCR với cặp mồi liên kết gen kháng Xa4.
Sản phẩm PCR với cặp mồi liên kết gen kháng xa5.
Sản phẩm PCR với cặp mồi liên kết gen kháng Xa7.
Sản phẩm PCR với cặp mồi liên kết gen kháng Xa21.
3.4.2 Đánh giá và chọn các cá thể BC3F1 đã lấy lại nền di truyền của TBR225
+ Bảng số liệu về các đặc điểm sinh trưởng và hình thái của các cá thể mang gen kháng bệnh bạc lá
+ Bảng số liệu đánh giá về yếu tố cấu thành năng suất của các cá thể BC3F1.
3.4.3. Đánh giá các các thể BC3F2 mang gen kháng bạc lá bằng chỉ thị phân tử
Sản phẩm PCR với cặp mồi liên kết gen kháng Xa4.
Sản phẩm PCR với cặp mồi liên kết gen kháng xa5.
Sản phẩm PCR với cặp mồi liên kết gen kháng Xa7.
Sản phẩm PCR với cặp mồi liên kết gen kháng Xa21.
3.4.4. Đánh giá khả năng kháng bạc lá của các cá thể bằng lây nhiễm nhân tạo
Ảnh phản ứng kháng với vi khuẩn bạc lá và bảng số liệu đo đếm chiều dài vết bệnh với 3 chủng.
3.4.5. Đánh giá các cá thể mang đa gen kháng
+ Bảng số liệu về đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cá thể mang đa gen kháng
+ Bảng số liệu về một số đặc tính hình thái của cá thể mang đa gen kháng + Bảng số liệu năng suất và yếu tố cấu thành năng suất.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phương pháp nghiên cứu phân tử 3.5.1. Phương pháp nghiên cứu phân tử
+ Phương pháp tách chiết ADN:
Phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử xác định gen kháng bệnh bạc lá. AND tổng số được tách chiết theo phương pháp “NAOH extraction” của Wang (1992). Sau khi nhân AND bằng những cặp mồi chạy điện di theo phương pháp của
20
Khoa Genome thực vật trường Đại Học Công Nghệ Texas, Mỹ có cải tiến.
- Mẫu lá non được cắt nhỏ vào ống eppendorf 2ml. Thêm 200ul NaOH 0,25N. Nghiền mịn lá bằng máy nghiền RETSCH Mixer Mill MM200.
- Thêm 800ul dung dịch Tris HCL 100mM pH 7,5 trộn đều. - Ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 20 phút.
- Chuyển 200ul dung dịch vào ống eppendorf 1,5ul. Lưu giữ ở - 200C để làm dung dịch gốc.
+ Phương pháp khuyếch đại PCR:
Pha loãng dung dịch gốc 10 lần, sử dụng 5ul dung dịch AND pha loãng cho mỗi phản ứng PCR.
Phản ứng PRC được tiến hành trên máy Veriti96well Thermal cycler. Tổng dung dịch phản ứng là 15ul bao gồm 5ul AND, 0,15uM mồi, 0,2mM dNTPs, 1X dịch đệm PCR, 2,5mM MgCl2 và 0,25 đơn vị Taq TaKaRa.
Điều kiện phản ứng PCR như sauu: 95oC- 7 phút; 35 chu kỳ của: 94oC-15 giây, 55oC- 30 giây, 72oC- 1 phút, giữ mẫu ở 4oC.
Phương pháp điện di trên gel agrose: Sản phẩm PCR được phân giải trên gel agarose 2,5% sử dụng phương pháp của Khoa Genome thực vật trường Đại học công nghệ Texas, Mỹ (2002) có cải tiến.
Chuẩn bị gel: Bột Agarose được hòa tan trong dung dịch đệm TBE 0,5X với nồng độ 2,5%.
-Đun sôi dung dịch agarose bằng lò vi sóng nóng -Hạ nhiệt độ của gel agarose xuống khoảng 50oC -Chuẩn bị khay gel và lượng
-Rót hỗn hợp gel agarose (EtBr) vào khay gel và cắm lượng -Thời gian chờ gel đông khoảng 40- 60 phút
-Chuẩn bị đệm dung dịch TBE 0,5X cho vào bể chạy điện di -Chạy điện di tại 100mA trong 3 giờ
-Rửa gel trong H2O, đặt gel vào máy soi UV và chụp hình ảnh
- Số liệu được đọc và phân tích các hình ảnh điện di các sản phẩm PCR để phát hiện những chỉ thị phân tử cho đa hình giữa các giống mang gen kháng bệnh bạc lá với những giống lúa nghiên cứu.
21
3.5.2. Thí nghiệm đồng ruộng đánh giá kiểu hình
* Thí nghiệm đánh giá tập đoàn:
- Bố trí thí nghiệm theo phương pháp khảo sát tập đoàn tuần tự không nhắc lại diện tích ô thí nghiệm 10m2 , các cá thể thế hệ BC3F1 có 1 đối chứng là TBR225.
- Khoảng cách cấy hàng x hàng = 25 cm, cây cách cây = 15cm, cấy 1 dảnh/ khóm, phân bón, tưới nước, và phòng trừ sâu bệnh áp dụng theo sản xuất đại trà.
+ Các chỉ tiêu theo dõi
-Thời gian sinh trưởng: Tính từ khi gieo đến khi có 85% số hạt chín trên các khóm.
-Chiều cao cây: Đo từ mặt đất đến đỉnh bông cao nhất không kể râu -Dảnh hữu hiệu: Đếm tất cả các bông trong một khóm.
-Số hạt chắc trên bông
-Khối lượng 1000 hạt (g): Phơi khô hạt đạt độ ẩm 13%.
-Năng suất lý thuyết = Mật độ × Số bông hữu hiệu/khóm × Số hạt chắc/bông × khối lượng 1000 hạt (g) × 1/1000
-Năng suất thực thu: Lấy mẫu theo từng khóm, tuốt hạt và phơi đến khi độ ẩm của hạt đạt tới 13% thì cân khối lượng, rồi quy ra gam/khóm.
3.5.3. Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo
+ Phương pháp lây nhiễm và đánh giá
Sử dụng Phương pháp lây nhiễm nhân tạo bệnh bạc lá, phương pháp cắt kéo. Giai đoạn lây nhiễm: lúa làm đòng - trỗ.
- Trồng cây trong nhà lưới có mái che, khoảng cách trồng 20-30 cm, cấy 1 dảnh khi mạ được 4-5 lá.
- Lượng phân bón 90 kg N + 90 kg P2O5 + 60 kg K2O. Bón thúc đợt 1 khi lây nhiễm khoảng 10 ngày (Giai đoạn từ làm đòng đến trỗ) với lượng 40% đạm tổng số để tăng cường khả năng phát bệnh.
- Đeo thẻ đánh dấu vào cây, mỗi màu thẻ lây một chủng
- Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn: Vi khuẩn lấy từ khuẩn lạc được bảo quản và được cấy lại trên môi trường Wakimoto trong ống nghiệm nghiêng sau 48 tiếng. Đổ 10ml nước cất vô trùng vào ống nghiệm nuôi cấy khuẩn lạc, sau đó votex để trộn đều. Đo nồng độ vi khuẩn và điều chỉnh để đạt được 108 tế bào trên 1ml là
22 thích hợp cho lây nhiễm.
- Chọn lá xanh khoẻ, nhúng kéo vào dung dịch vi khuẩn, sau đó cắt đoạn đầu lá dài từ 1-3cm, cứ 3-5 lá lại phải nhúng kéo vào dung dịch vi khuẩn một lần, vuốt gọn đầu lá một cây rồi cắt, để tránh nhầm sang lá và cây bên cạnh.
- Giữ ẩm ruộng lúa thường xuyên
- Sau 18-20 ngày lây nhiễm tiến hành đo đếm chiều dài vết bệnh. Đo toàn bộ các lá lây nhiễm. Đo từ đầu vết cắt xuống phía dưới đến hết vết bệnh, tính trung bình. Dựa vào chiều dài vết bệnh để đánh giá tính kháng, nhiễm.
Theo thang điểm 5 cấp (Sử dụng khi lây nhiễm các dòng nhỏ được cấy trong nhà lưới) như sau:
Chiều dài vết bệnh < 3 cm Kháng cao (HR) Chiều dài vết bệnh 3 - 8 cm Kháng (R)
Chiều dài vết bệnh 8 - 12 cm Kháng trung bình (M) Chiều dài vết bệnh 12 - 17 cm Nhiễm (S)
Chiều dài vết bệnh > 17 cm Nhiễm cao (HS)
3.5.4. Thí nghiệm đánh giá dòng triển vọng
+ Phương pháp bố trí thí nghiệm
Khoảng cách cấy hàng x hàng = 25 cm, cây cách cây = 15cm, cấy 1 dảnh/ khóm, phân bón, tưới nước và phòng trừ sâu bệnh áp dụng theo sản xuất đại trà