PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu bao gồm: 3 dòng ngô thuần mang gen chịu hạn ZmDREB2A (ở thế hệ T6) ký hiệu D3, D14 và D21. 3 sự kiện chuyển gen được tạo ra thông qua phương pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium, Vector pCAMBIA1300 mang gen chịu hạn ZmDREB2A chuyển vào phôi non của 3 dòng ngô nền tương ứng có khả năng tái sinh cao là C436, C7N và V152. Các sự kiện đã được đánh giá bằng các kỹ thuật phân tử và chọn lọc qua các thế hệ thể hiện sự có mặt và biểu hiện ổn định của gen chuyển trong các dòng ngô. 12 THL được tạo ra từ thí nghiệm lai đỉnh giữa 3 dòng ngô chuyển gen và 3 dòng ngô nền với 2 cây thử là các dòng ngô thuần ưu tú NT6745 và H45.
Bảng 3.1. Danh sách các THL đỉnh tham gia thí nghiệm
TT Ký hiệu THL Dòng mẹ Dòng bố Ghi chú
1 D3xNT D3 NT6745 THL chuyển gen
2 D14xNT D14 NT6745 THL chuyển gen
3 D21xNT D21 NT6745 THL chuyển gen
4 C436xNT C436 NT6745 THL nền (không chuyển gen)
5 C7NxNT C7N NT6745 THL nền (không chuyển gen)
6 V152xNT V152 NT6745 THL nền (không chuyển gen)
7 D3xH D3 H245 THL chuyển gen
8 D14xH D14 H245 THL chuyển gen
9 D21xH D21 H245 THL chuyển gen
10 C436xH C436 H245 THL nền (không chuyển gen)
11 C7NxH C7N H245 THL nền (không chuyển gen)
12 V152xH V152 H245 THL nền (không chuyển gen)
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung 1: Đánh giá khả năng chịu hạn và một số chỉ tiêu hóa sinh của các dòng mang gen ZmDREB2A và dòng nền tương ứng thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo giai đoạn cây con trong điều kiện nhà lưới.
Nội dung 2: Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng mang gen ZmDREB2A và dòng nền tương ứng thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo giai đoạn trước trỗ trong điều kiện nhà lưới.
24
Nội dung 3: Đánh giá khả năng chịu hạn của các THL đỉnh mang sự kiện chuyển gen ZmDREB2A và THL nền tương ứng thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo vụ Hè Thu 2019 tại Đan Phượng, Hà Nội.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng chịu hạn và một số chỉ tiêu hóa sinh của các dòng mang gen ZmDREB2A và dòng nền tương ứng thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo giai đoạn cây con trong điều kiện nhà lưới
* Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn giai đoạn cây con: được
tiến hành từ tháng 3 đến tháng 4 năm 2019, trong điều kiện nhà lưới với 3 lần nhắc và 2 công thức:
+ Công thức 1: Tưới nước đầy đủ
+ Công thức 2: Đến giai đoạn cây con 4-5 lá thì tiến hành thí nghiệm chịu hạn nhân tạo bằng cách không tưới nước trong 14 ngày, sau đó phục hồi trong 7 ngày (tưới nước đầy đủ).
Các dòng ngô được gieo trong chậu chứa giá thể xỉ than (có thể rút nước chủ động) đã tưới nước bão hòa, mỗi chậu gieo một dòng và gieo 10 hạt trên chậu. Các dòng ngô được tưới dung dịch dinh dưỡng đảm bảo cây sinh trưởng phát triển đồng đều. Tỉa bỏ các cây không đồng đều chỉ giữ lại 5 cây/chậu/dòng. Đến giai đoạn cây con 4-5 lá tiến hành thí nghiệm chịu hạn nhân tạo bằng cách không tưới nước liên tục trong 14 ngày. Tiến đánh giá đặc điểm hình thái và mức độ héo lá của các dòng ngô. Đối chứng là những dòng ngô không chuyển gen. Các chỉ tiêu theo dõi:
- Đánh giá mức độ héo lá được theo dõi: đánh giá mức độ héo của lá sau 5 ngày, 10 ngày và 14 ngày sau gây hạn.
- Đánh giá khả năng phục hồi và tỷ lệ sống sót của các dòng ngô trong điều kiện hạn 14 ngày và sau 7 ngày tưới nước phục hồi theo công thức:
Tỷ lệ cây sống (%) = (Số cây sống/ Tổng số cây xử lý)x100
- Các chỉ tiêu theo dõi liên quan đến khả năng chịu hạn của các dòng được đánh giá theo phương pháp của Camacho & Caraballo (1994).
+ Thể tích rễ (RV) được xác định bằng cách cho rễ vào ống đong, đổ nướ́c ngập ghi thể tích ta có giá trị thể tích tổng (V(tổng)) sau đó vớt rễ ra ghi thể tích là thể tích nước V(nước), công thức tính thể tích rễ RV = V(tổng) - V (nước);
25
+ Chiều dài rễ dài nhất (LRL)(cm): đo từ đốt mang rễ đầu tiên đến rễ dài nhất;
+ Chiều cao cây (PH)(cm): đo từ đốt đầu tiên mang rễ đến lá dài nhất; + Khối lượng rễ tươi (RFW)(g), khối lượng thân tươi (SFW)(g); khối lượng rễ khô (RDW)(g); khối lượng thân khô (SDW)(g), tỷ lệ rễ khô/thân khô; tổng sinh khối khô (TMD) được cân bằng cân điện tử và độ chính xác 0,01g.
* Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu hóa sinh:
+ Quy trình phân tích hàm lượng Chlorophyll trong lá: Hút 10ml ethanol 96% vào ống falcon. Cắt một phần lá, định lượng khối lượng hoặc diện tích của phần lá đó rồi cho vào ống falcon chứaa ethanol. Cất giữ ống falcon chưa mẫu ở chỗ tối trong 24-48h. Đem dịch thu được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 665 và 649. Lượng chlorophyll trong mẫu lá đc tính theo công thức: Chl a = 13.70 x A665 – 5.76 x A649 (µg/ml); Chl b = 25.8 x A649 – 7.60 x A665 (µg/ml);
+ Quy trình phân tích đạm tổng số: Quy trình phân tích đạm theo phương pháp Kjeldahn (1883) có cải tiến. Phương pháp gồm 3 bước chính: Công phá mẫu (chuyển đạm từ dạng liên kết về dạng muốn amoni sunfate), chưng cất và chuẩn độ (tính hàm lượng đạm dựa trên số ion amonia có trong dung dịch nhận);
+ Phương pháp phân tích NSC (Ohnichi & Horie, 1999). Cân 0.5 g mẫu khô đã nghiền nhỏ cho vào ông falcon 50ml, thêm 30ml nước cất rồi đun ở 100o
trong 60 phút. Sau khi để nguội thêm vào mỗi ống 20ml dung dịch Sodium phosphate-phosphoric acid buffer. Đem lắc ở 200 vòng/phút ở nhiệt độ 40o trong 24h để NSC được phân hủy ra dung dịch. Mang mẫu lọc bằng giấy lọc rồi làm khô phần cặn thu được ở 135oC trong 4h. Cân lượng mẫu còn lại rồi tính lượng NSC theo CT: NSC (%) = (KL mẫu/KL mẫu sau sấy)/KL mẫu x 100;
+ Phương pháp phân tích proline tự do trong cây: Tiến hành nghiền 0,5g mẫu lá bằng nito lỏng rồi nghiền tiếp trong 10ml axit sulfosalicylic 3%. Sau đó lọc qua giấy lọc, bỏ cặn. Hút 2ml dung dịch mẫu cho phản ứng với 2ml axit axetic glacial và 2ml axit ninhydrin, phản ứng được thực hiện ở 100oC trong 1 giờ. Kết thúc phản ứng, hỗn hợp được làm lạnh trong khay đá. Thêm vào hỗn hợp phản ứng 4ml toluene, trộn đều bằng máy lắc vortex trong 15-20 giây. Sau khi hỗ hợp phản ứng bị tách làm 2 pha, hút pha lỏng phía trên (có màu hồng nhạt) và đo ở bước sóng 520nm. Dựa trên bước sóng đo được ở dãy proline chuẩn để tính lượng proline có trong mẫu.
26
Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng mang gen ZmDREB2A và dòng nền tương ứng thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo giai đoạn trước trỗ trong điều kiện nhà lưới
Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 2 đến tháng 5 năm 2019, trong điều kiện nhà lưới tại Viện Nghiên cứu Ngô.
Phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn của các cây chuyển gen giai đoạn trước trỗ (CIMMYT, 2004; Cains & cs., 2013).
Các dòng ngô được gieo trong xô chứa giá thể trong điều kiện nhà lưới. Sau khi cây ngô được 3 lá tiến hành tỉa bỏ các cây không đồng đều chỉ giữ lại 1 cây/xô/dòng, mỗi dòng 5 xô với hai công thức xử lý hạn và tưới nước đầy đủ. Các xô thí nghiệm được bón phân và tưới nước đồng đều ở mỗi xô để cây sinh trưởng phát triển bình thường cho đến thời điểm trước trỗ tiến hành ngừng tưới nhằm gây hạn nhân tạo đối với các dòng ngô trong công thức xử lý hạn, còn các dòng ngô trong không thức không xử lý hạn vẫn tưới nước đầy đủ. Thời gian xử lý hạn là 14 ngày. Sau 14 ngày gây hạn các xô thí nghiệm tưới nước trở lại để cây phát triển bình thường cho đến khi thu hoạch. Các chỉ tiêu theo dõi trong quá trình thí nghiệm gồm:
- Ngày trỗ cờ: Ngày có trên 75% số cây có hoa nở ở 1/3 trục chính - Ngày phun râu: Ngày có trên 75% số cây có râu nhú dài từ 2 đến 3cm - Ngày chín: Ngày có trên 75% cây có lá bi khô hoặc chân hạt có chấm đen. - Đánh giá độ cuộn của lá ngô: theo thang điểm từ 1-5: điểm 1: lá không cuộn, điểm 2: mép lá mới cuộn, điểm 3: mép lá cuộn hình chữ V, điểm 4: mép lá cuộn vào trong, điểm 5: lá cuộn tròn.
- Số lá thật: cắt đánh dấu lá thứ 5 và lá thứ 10 để tiện cho việc đếm tổng số lá cuối cùng
- Chiều cao cây: đo từ mặt xô thí nghiệm đến đốt phân nhánh cờ đầu tiên. - Chiều dài cờ: đo từ đốt phân nhánh cờ đầu tiên đến đỉnh của trục chính. - Số nhành cờ: đếm số nhánh cờ cấp 1
- Các yếu tố cấu thành năng xuất: chiều dài bắp, đường kính bắp, số hàng hạt, số hạt trên hàng, tỷ lệ khối lượng hạt/bắp, khối lượng 1000 hạt và năng suất của các dòng.
27
NSTT =
P.ô x KE × (100 - A0)
× 100 S.ô × (100 -140)
trong đó: P.ô: khối lượng bắp tươi/ô (kg) KE: tỷ lệ hạt tươi/bắp tươi (%)
Ao: độ ẩm hạt khi thu hoạch (%); S.ô: diện tích ô thí nghiệm (m2)
Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng chịu hạn của các THL đỉnh mang sự kiện chuyển gen ZmDREB2A và THL nền tương ứng thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo ngoài đồng ruộng.
Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 2 đến tháng 6 năm 2019, trong điều kiện nhà lưới tại Viện Nghiên cứu Ngô.
Thí nghiệm được bố trí trong điều kiện hạn có kiểm soát, theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD), 3 lần nhắc lại; Diện tích ô 11,2 m2 (4 m x 2,8 m); Khoảng cách giữa các lần nhắc lại 1m; Các giống được gieo liên tiếp nhau, gieo 4 hàng/ô; Mật độ khoảng cách: hàng dài 4 m, hàng cách hàng 70 cm, cây cách cây 20 cm; Xung quanh thí nghiệm bố trí có băng bảo vệ, trồng 2 hàng ngô;
Điều khiển gây hạn có kiểm soát theo phương pháp của CIMMYT (Zaman- Allah & cs., 2016): Điều khiển chế độ tưới nước, tưới một cách chủ động theo yêu cầu của từng giai đoạn sinh trưởng, phát triển. Thí nghiệm gây hạn dừng tưới ngay sau giai đoạn V5-V6 cho đến thời điểm hạn tối đa (sau trỗ 2 tuần, để đảm bảo cây ngô bị hạn). Các chỉ tiêu theo dõi:
- Ngày tung phấn (AD): Xác định từ ngày gieo đến 50% số cây tung phấn /công thức (ngày).
- Ngày phun râu (SD): Được xác định là số ngày từ khi gieo đến 50% số cây phun râu /công thức (ngày).
- Chênh lệch thời gian từ gieo đến tung phấn - phun râu (ASI): Được tính bằng công thức: ASI = AD – SD (ngày).
- Chín sinh lý: Từ ngày gieo đến khi xuất hiện điểm đen chân hạt (ngày).
3.4. PHÂN TÍCH SỐ LIỆU
Các số liệu được thu thập và xử lý trên các phần mềm chuyên dụng. Số liệu về các chỉ tiêu đặc điểm nông sinh học và đánh giá khả năng chịu hạn giai đoạn cây con và giai đoạn trước trỗ của các dòng/THL ngô được xử lý trên phần mềm Excel 2016 và phần mềm IRRISTAT 5.0.
28