PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ MỘT SỐ CHỈ
4.1.2. Đánh giá một số chỉ tiêu hóa sinh của các dòng ngô thông qua thí nghiệm
nghiệm gây hạn nhân tạo ở giai đoạn cây con
Phản ứng của cây ngô đối với điều kiện hạn thể hiện qua các cơ chế sinh lý, sinh hóa khác nhau. Một cơ chế sinh hóa giúp chống chịu đối với điều kiện hạn ở cây ngô là sự tích lũy các chất hòa tan như proline, betaines, các hợp chất polyols và các dạng carbohydrate. Các hợp chất này không chỉ giúp duy trì tính đàn hồi thành tế bào mà còn đóng vai trò duy trì sức trương của tế bào (Yancey & cs.,
1982). Trong đó, hàm lượng proline được coi là một chỉ tiêu quan trọng trong đánh giá khả năng chịu hạn của cây trồng. Sự tích lũy amino acid như proline tăng cao khi cây gặp phải điều kiện bất lợi như hạn (Mansour, 2000). Vai trò của proline trong đáp ứng với điều kiện hạn thể hiện qua việc giúp ổn định các hệ thống màng sinh học cũng như các protein chức năng, đồng thời hỗ trợ bảo vệ, giảm thiểu tác động gây hại từ gốc oxy hóa tự do.
4.1.2.1. Kết quả phân tích hàm lượng chlorophyll
Qua kết quả phân tích hàm lượng chlorophyll trong thân lá của các dòng ngô cho thấy ở công thức tưới nước đầy đủ, hàm lượng chlorophyll tổng số cũng như hàm lượng chlorophyll a và chlorophyll b trong thân lá của các dòng chuyển gen và dòng nền mặc dù có sự khác nhau nhưng không có ý nghĩa đáng kể. Trong công thức sau 14 ngày gây hạn, hàm lượng chlorophyll trong các dòng giảm rõ rệt so với công thức đối chứng. Trong đó hàm lượng chlorophyll trong các dòng nền giảm cao mạnh nhất hay nói cách khác hàm lượng chlorophyll của các dòng chuyển gen đều cao hơn có ý nghĩa so với dòng nền tương ứng ở công thức sau 14 ngày gây hạn nhân tạo.
Từ số liệu bảng 4.6 cho thấy ở công thức gây hạn CT2, dòng ngô chuyển gen D3 có hàm lượng chlorophyll tổng số trong lá cao nhất đạt 14,72 cao hơn gấp 2 lần so với dòng nền không chuyển gen C436. Dòng D21 chuyển gen có hàm lượng không thấp hơn nhiều so với dòng D3 chuyển gen, đạt 14,01 gấp hơn 3 lần so với đối chứng là dòng nền V152 không chuyển gen. Dòng D14 cho hàm lượng chlorophyll thấp nhất sau công thức xử lý hạn liên tục 14 ngày. Các số liệu thực hiện với công thức không xử lý hạn (CT1), hàm lượng chlorophyll khá tương đồng giữa các dòng ngô chuyển gen và không chuyển gen.
37
Hàm lượng chlorophyll là một chỉ tiêu quan trọng khi đánh giá đặc điểm sinh lý, sinh hóa cây trồng. Đối với cây gặp phải điều kiện bất lợi từ môi trường như hạn hán, nhiệt độ môi trường cao hay đất mặn, hàm lượng chlorophyll có xu hướng giảm. Ở những cây có khả năng chịu hạn, để duy trì hàm lượng và hoạt động của chlorophyll, việc tổng hợp anthocyanin tăng cao giúp bảo vệ chlorophyll (Chutipaijit & cs., 2008).
Bảng 4.6. Hàm lượng Chlorophyll tổng số, Chlorophyll a và b trong các dòng ngô sau thí nghiệm xử lý hạn nhân tạo
TT Tên Hàm lượng chrolophyll tổng số (mg/ml) Hàm lượng chrolophyll a (mg/ml) Hàm lượng chrolophyll b (mg/ml) CT1 CT2 CT1 CT2 CT1 CT2 1 D3 24,56 14,72 19,47 8,27 5,09 6,45 2 Dòng nền C436 19,90 7,58 14,30 4,86 5,60 2,72 3 D14 18,29 11,84 13,47 8,75 4,82 3,09 4 Dòng nền C7N 26,01 8,72 18,42 7,56 7,59 1,16 5 D21 31,43 14,01 24,38 10,31 7,05 3,70 6 Dòng nền V152 33,28 4,41 26,12 2,92 7,16 1,49
Chú thích: CT1- công thức tưới nước đầy đủ; CT2- công thức gây hạn
Trong bảng 4.6 khi đánh giá hàm lượng chlorophyll a từ các dòng ngô thí nghiệm sau xử lý hạn nhân tạo ở giai đoạn cây con đều thấy sự giảm mạnh hàm lượng chlorophyll ở công thức xử lý hạn. So sánh giữa các dòng ngô chuyển gen, hàm lượng chlorophyll a đạt cao nhất trong điều kiện xử lý hạn là ở sự kiện D21 (10,31 mg/ml) gấp 3,5 lần so với dòng nền V152 (2,92 mg/ml). Tiếp theo là hàm lượng chlorophyll ở dòng D14 chuyển gen đạt 8,75 mg/ml nhưng nếu so với dòng nền C7N thì mức tăng thêm chỉ đạt 16%. Sự kiện D3 có hàm lượng chlorophyll a trong điều kiện hạn là 8,27 mg/ml cao hơn có ý nghĩa so với dòng nền C436 (2,92).
Tương tự, đối với hàm lượng chlorophyll b, Dòng D3 chuyển gen là dòng có hàm lượng chlorophyll b cao nhất trong điều kiện hạn nhân tạo, đạt 6,45 mg/ml gấp gần 2,4 lần so với dòng nền C436 (đạt 2,72 mg/ml). Với hàm lượng chlorophyll b đạt 3,7 mg/ml, Dòng D21 chuyển gen là dòng có hàm lượng chlorophyll b cao thứ hai trong các dòng chuyển gen, gấp 2,48 lần so với dòng nền V152 không chuyển gen. Dòng D14 có hàm lượng chlorophyll b thấp nhất trong các dòng chuyển gen, đạt 3,09 mg/ml.
Khi lượng nước trong lá giảm vượt qua ngưỡng cho phép, khí khổng đóng lại để làm chậm quá trình thoát hơi nước, làm giảm hàm lượng CO2, ảnh
38
hưởng đến quá trình quang hợp. Chlorophyll là một chỉ số thể hiện khả năng quang hợp, liên quan trực tiếp đến quá trình tăng trưởng của cây (Nageswara Rao, 2001). Hàm lượng chlorophyll trong lá tăng cao đã tăng cường tính chịu hạn của cây, giúp cây nhanh phục hồi sau hạn. Sự gia tăng khối lượng lục lạp trong tế bào nhu mô lá giúp cây hoàn thành chức năng quang hợp, duy trì sự sống, thích nghi với điều kiện khắc nghiệt của môi trường. Điều này cho thấy sắc tố quang hợp (chlorophyll) trong lá được tăng cường, giúp cây thích nghi với điều kiện khô hạn.
4.1.2.2. Kết quả phân tích hàm lượng đạm tổng số và hydrat cacbon không cấu trúc
Đạm là thành phần quan trọng đối với tất cả các tế bào. Khi cây trồng gặp điều kiện hạn, thiếu nước làm cản trở các hoạt động trao đổi chất như quang hợp, từ đó làm giảm hàm lượng đạm có trong cây. Tuy nhiên, cây có khả năng chịu hạn tốt hơn sẽ duy trì được hàm lượng đạm cao hơn so với cây không có khả năng chịu hạn. Hàm lượng đạm tổng số là một chỉ số sinh lý quan trọng có thể cho biết khả năng cây trồng có thể sống tồn tại dưới điều kiện hạn.
Hàm lượng đạm tổng số trong bảng 4.7 cho thấy khi xử lý hạn nhân tạo, hàm lượng đạm tổng số ở dòng D3 chuyển gen đạt cao nhất (1,95%) và thấp nhất trong các dòng chuyển gen là dòng ngô D14 chuyển gen (1,4%). Các số liệu khi thực hiện công thức thí nghiệm không xử lý hạn (CT1) cho thấy sự sai khác không lớn giữa các dòng chuyển gen và không chuyển gen.
Bảng 4.7. Hàm lượng đạm tổng số trong các dòng cây chuyển gen và dòng nền sau thí nghiệm xử lý hạn nhân tạo
TT Dòng Hàm lượng N tổng số (%) Hàm lượng NSC (mg/g) CT1 CT2 CT1 CT2 1 D3 2,00 1,95 33,03 22,33 2 Dòng nền C436 2,17 0,91 37,20 7,33 3 D14 2,09 1,4 40,58 22,46 4 Dòng nền C7N 2,20 1,02 32,39 13,67 5 D21 2,50 1,81 36,62 29,95 6 Dòng nền V152 2,32 1,54 23,12 9,56
Chú thích: CT1- công thức tưới nước đầy đủ; CT2- công thức gây hạn
Kết quả phân tích hàm lượng hydrat cacbon không cấu trúc (NSC) cho thấy dòng chuyển gen D21 có hàm lượng hydrat cacbon không cấu trúc cao nhất trong điều kiện hạn, đạt 29,95 mg/g, gấp khoảng 3 lần so với dòng nền V152 không
39
chuyển gen. Dòng D14 và D3 chuyển gen có hàm lượng hydrat cacbon không cấu trúc trong điều kiện hạn xấp xỉ nhau, tương ứng là 22,46 và 22,33 mg/g.
Tuy nhiên, nếu so sánh với dòng không chuyển gen thì dòng D14 chuyển gen có hàm lượng hydrat cacbon không cấu trúc chỉ gấp 1,6 lần trong khi hàm lượng này ở dòng D3 chuyển gen gấp 3 lần so với dòng nền C436 không chuyển gen. Giữa công thức CT1 và CT2, sự giảm hàm lượng hydrat cacbon không cấu trúc của các dòng chuyển gen không nhiều nhưng đối với các dòng nền không chuyển gen, có thể quan sát thấy hàm lượng hydrat cacbon không cấu trúc giảm mạnh sau thí nghiệm xử lý hạn liên tục 14 ngày.
Trong nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen AtNHX1 (liên quan đến kênh vận chuyển Na+/H+) từ Arabidopsis thaliana ở cây Brassica napus giúp tăng khả năng chống chịu stress về áp suất thẩm thấu như stress mặn (Hong-Xia Zhang & cs., 2001). Kết quả thí nghiệm cho thấy các cây chuyển gen có hàm lượng protein tổng số cao hơn cây kiểu dại khi đặt trong môi trường mặn. Ở nồng độ NaCl 10mM, hàm lượng protein tổng số trong lá cây mang gen AtNHX1 đạt khoảng 2,22 g/100g khối lượng khô, cao hơn so với cây không mang gen (khoảng 2,2 g/100g khối lượng khô). Hàm lượng protein tổng số ở cây mang gen và không mang gen AtNHX1 trong môi trường 10mM là như nhau ở hệ rễ, đạt 0,9 g/100g khối lượng khô.
Các loại hydrat cacbon không cấu trúc như glucose, fructose, sucrose, trehalose, raffinose… là các chất điều hòa thẩm thấu, với đặc điểm tan tốt trong nước, mang điện trung tính trong điều kiện pH bình thường và không ức chế hoạt động của các enzyme ngay cả ở nồng độ cao. Các hydrat cacbon không cấu trúc giúp làm giảm thế nước trong tế bào, duy trì độ trương của tế bào, bảo vệ các cấu trúc dưới tế bào do có khả năng liên kết với các protein cũng như các hệ thống màng sinh học, giữ cho chúng không bị biến tính (Koyro & cs., 2012).
Theo nghiên cứu của nhiều nhóm nghiên cứu các nhà khoa học quốc tế cho thấy hàm lượng cao các hợp chất carbohydrate phi cấu trúc có thể giúp cây cối vùng nhiệt đới kéo dài thời gian sống sót thêm 17 ngày trong các đợt hạn hán khắc nghiệt.
Trong nhiều nghiên cứu sinh lý học thực vật trước đây, NSC được chứng minh có vai trò quan trọng đối với khả năng phục hồi của cây trong điều kiện khô hạn. Trong nghiên cứu mới, các nhà khoa học tiến hành quan sát phản ứng của thực vật bằng cách trồng 1.400 cây con thuộc 10 giống cây nhiệt đới khác nhau
40
và chia thành 2 nhóm. Họ dưỡng nhóm cây thứ nhất trong điều kiện thiếu ánh sáng trước khi cho chúng tiếp xúc với ánh nắng, còn nhóm cây thứ hai thì ngược lại, tức là ban đầu được trồng dưới ánh nắng sau đó di dời vào trong tối. Kết quả cho thấy nhóm cây thứ hai đã biểu hiện sụt giảm NSC rõ rệt, giúp các chuyên gia so sánh khả năng sinh tồn của chúng so với nhóm cây thứ nhất – nhóm có hàm lượng NSC bình thường. Điều này cho thấy nhóm cây dự trữ NSC nhiều hơn có thể duy trì lượng nước trong thân lâu hơn so với nhóm cây còn lại.
4.1.2.3. Kết quả phân tích hàm lượng Lipit và hàm lượng Carotenoid
Từ bảng 4.8 cho thấy hàm lượng lipit trong các mẫu dưới điều kiện hạn giao động từ 1.06 – 1.88 g/100g chất mẫu. Hàm lượng lipit ở các dòng chuyển gen đều cao hơn ở các dòng nền và cao nhất là sự kiện D21, thấp nhất là sự kiện D14. Hàm lượng lipit đều tăng trong điều kiện hạn trong khi các dòng chuyển gen và dòng nền không chuyển gen trong điều kiện không gây hạn nhân tạo đều không có sự khác biệt có ý nghĩa.
Điều kiện hạn tác động đến tế bào thực vật và gây ra các đáp ứng khác nhau. Đáp ứng của tế bào với stress hạn thể hiện thông qua các quá trình như tích lũy các chất điều hòa thẩm thấu và tăng cường hoạt động của các enzyme, chất chống oxy hóa (do stress hạn tạo ra các gốc oxy tự do gây hại). Việc sử dụng các chất điều hòa thẩm thấu là một chiến lược phổ biến và quan trọng trong các đáp ứng với stress hạn đối với nhiều loài sinh vật khác nhau. Nhóm nghiên cứu của Hong và cộng sự thấy có sự tăng cường hàm lượng lipid tổng số trong lá cây
Brassica napus chuyển gen AtNHX1 so với kiểu dại khi gây stress áp suất thẩm thấu bằng NaCl 10mM. Đối với hệ rễ, chênh lệch về hàm lượng lipid tổng số giữa cây chuyển gen và kiểu dại không đáng kể.Trong đó nhiều tác giả chỉ ra rằng cây trồng có cơ chế chịu hạn và chịu mặn như nhau.
Bảng 4.8. Hàm lượng Lipit và hàm lượng Carotenoid trong các dòng cây chuyển gen và dòng nền sau thí nghiệm xử lý hạn nhân tạo
TT Dòng Hàm lượng Lipit (g/100g) Hàm lượng Carotenoid (mg/100g) CT1 CT2 CT1 CT2 1 D3 1,05 1,49 9,83 8,70 2 Dòng nền C436 1,12 1,38 10,04 7,67 3 D14 1,08 1,29 10,73 8,60 4 Dòng nền C7N 1,09 1,06 10,80 8,20 5 D21 1,06 1,88 9,31 12,00 6 Dòng nền V152 1,12 1,51 9,40 7,75
41
4.1.2.4. Kết quả phân tích hàm lượng Proline và hàm lượng nước
Cây ngô bị tác động có hại bởi nhiều yếu tố môi trường trong quá trình sinh trưởng phát triển trong đó yếu tố hạn được cho là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất ngô toàn thế giới. Các cơ chế liên quan đến khả năng chịu hạn của cây ngô bao gồm sự tích lũy các chất hòa tan như proline, betaines, polyols và đường, các hợp chất này không chỉ duy trì tính đàn hồi thành tế bào mà còn đóng vai trò duy trì sức trương của lá (Yancey & cs., 1982).
Qua kết quả bảng 4.9 cho thấy sau xử lý hạn nhân tạo, hàm lượng proline trong mẫu lá của các dòng cây chuyển gen và đối chứng dòng nền không chuyển gen đều tăng so với công thức đối chứng không xử lý hạn (CT1). Hàm lượng proline ở các mẫu dòng chuyển gen đều tăng cao hơn so với dòng nền không chuyển gen và đạt cao nhất là dòng D3 chuyển gen (126,21 mg/100g) trong khi dòng nền chỉ đạt 88,42 mg/100g. Tiếp đến là dòng D21 chuyển gen (97,3 mg/100g) so với dòng nền V152 không chuyển gen (80,55 mg/100g). Dòng D14 chuyển gen và không chuyển gen có sự chênh lệnh không đánh kể về hàm lượng proline sau quá trình gây hạn nhân tạo. Ở công thức không gây hạn, hàm lượng proline ở tất cả các nguồn dòng không có sự sai khác có ý nghĩa thể hiện tính tương đồng và tính ổn định của các gen chuyển trong cây chuyển gen và dòng nền không chuyển gen.
Bảng 4.9. Hàm lượng Proline trong các dòng cây chuyển gen và dòng nền sau thí nghiệm xử lý hạn nhân tạo
TT Dòng Hàm lượng Proline (mg/100g) Hàm lượng nước (g/100g) CT1 CT2 CT1 CT2 1 D3 56.50 126.21 83,92 69,55 2 Dòng nền C436 57.10 88.42 83,82 53,12 3 D14 59.63 79.10 83,76 63,14 4 Dòng nền C7N 56.46 72.40 82,98 50,42 5 D21 59.58 97.30 83,59 63,68 6 Dòng nền V152 59.70 80.55 83,64 52,50
Chú thích: CT1- công thức tưới nước đầy đủ; CT2- công thức gây hạn
Proline là một amino axit có vai trò quan trọng trong sự điều hòa áp suất thẩm thấu trong tế bào. Các nghiên cứu đã cho thấy có sự tích lũy amino acid như proline khi cây gặp phải điều kiện bất lợi như hạn (Mansour, 2000). Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sự tích lũy prolin có thể tăng 10 đến 100 lần ở
42
thực vật dưới tác động của áp suất thẩm thấu. Proline giúp ổn định các màng và protein chức năng, hỗ trợ bảo vệ tránh các tác động từ gốc oxy tự do. Theo tác giả Chen & Muranta (2002), sức chống chịu của thực vật tăng lên khi được chuyển các gen mã hóa enzym tham gia vào con đường sinh tổng hợp prolin trong tế bào. Trên thực tế, một số thử nghiệm chuyển gen làm tăng cường biểu hiện proline đã cho thấy có thể cải thiện khả năng chống chịu stress của thực vật. Trong nghiên cứu của Efeoğlu & cs. (2009) trên 3 giống ngô Doge, Luce, Vero đã cho thấy hàm lượng proline tăng lên đáng kể trong giai đoạn gây hạn nhân tạo, sau đó giảm dần khi cây được tưới nước phục hồi. Trong khi hàm lượng proline của 3 giống ngô trong điều kiện không hạn dao động vào khoảng 1-1,5 µmol/g khối lượng mẫu thì hàm lượng proline ở giống Doge và Luce giai đoạn 12 ngày sau gây hạn đạt mức 15 µmol/g khối lượng mẫu, giá trị này thấp hơn một chút đối với giống Vero khi đạt khoảng 12 µmol proline/g khối lượng mẫu.
Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng nước ở các dòng ngô trong điều kiện được tưới nước đầy đủ (CT1) đạt xấp xỉ 83g/100g mẫu. Giữa nhóm dòng chuyển