Hiện nay trên thế giới, các nghiên cứu điển hình liên quan đến việc thay đổi hàm lượng đường RFOs trong đậu tương bằng các phương pháp chọn dòng, lai tạo đột biến gần đây nhất là việc ứng dụng công nghệ RNAi bước đầu đã thu được kết quả khả quan Cụ thể, nghiên cứu của Bilyeu và cộng sự cho thấy giảm biểu hiện của các gen RS2 (Glyma06g18890) mã hóa hai enzyme raffinose synthase và stachyose synthase xúc tác trực tiếp cho phản ứng tạo thành raffinose và stachyose, kết quả làm tăng hàm lượng đường sucrose đồng thời nhóm đường đơn như raffinose và stachyose sẽ giảm xuống Một số dòng đậu tương mang gen đột biến RS2 được khẳng định có chứa hàm lượng thấp raffinose trong hạt [38] Nghiên cứu trên dòng đậu tương tạo được bằng công nghệ RNAi nhằm giảm biểu hiện của gen RS2 cũng ghi nhận sự giảm xuống của đường raffinose trong hạt đậu tương và tăng hiệu suất tiêu hóa và hấp thu năng lượng của gia cầm sử dụng loại hạt này [15] Stachyose synthase là enzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp starchyose Các dòng đột biến tự nhiên cho thấy sự ức chế hoạt động của enzym này cũng làm tăng lượng đường trong hạt và giảm đáng kể hàm lượng starchyose trong hạt [39] Điều này cho thấy ý nghĩa quan trọng và mối liên hệ mật thiết giữa các enzyme tham gia quá trình sinh tổng hợp RFOs và hàm lượng các đường RFOs và đường sucrose
Tuy nhiên, nghiên cứu thay đổi hàm lượng RFOs thông qua việc tác động lên các gen mã hóa cho enzyme GOLS bằng công nghệ CRISPR/Cas9 nhằm giảm hàm lượng đường raffinose trong hạt đậu tương vẫn chưa được nghiên cứu cả trong và ngoài nước Luận án nghiên cứu đột biến 2 trong 6 gen mã hóa cho enzyme GOLS bằng CRISPR/Cas9, nhằm tác động đến hàm lượng galactinol làm ảnh hưởng quá trình sinh tổng hợp RFOs Kết quả nghiên cứu của luận án đã cho thấy sự thành công trong việc thiết kế cấu trúc chỉnh sửa gen CRISPR/Cas 9 có khả năng tạo đột biến định hướng trên 2 gen GmGOLS03 và GmGOLS19, tạo được các dòng đậu tương mang đột biến định hướng có hàm lượng raffinose thành phần và nhóm đường khó tiêu họ raffinose giảm, đồng thời tăng hàm lượng sucrose trong hạt, thông qua kết quả nghiên cứu đã khẳng định được vai trò của 2 gen GmGOL03 và GmGOL19 đối với việc sinh tổng hợp đường RFOs trong hạt đậu tương
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2 1 Vật liệu nghiên cứu
- Bốn giống đậu tương: Hai giống đậu tương ưu tú của Việt Nam ĐT22, ĐT26 được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ - Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm Việt Nam và hai giống đậu tương nước ngoài Maverick (Mr), William82 (WL 82) được cung cấp từ đại học Missouri-Colombia, MO, Hoa Kỳ
Trong đó giống đậu tương ĐT26 được chọn tạo bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ thuộc Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm – Viện Khoa
học Nông nghiệp Việt Nam chọn lọc từ tổ hợp lai giữa ĐT2000 x ĐT12, có khả năng kháng bệnh gỉ sắt, đốm nâu và khả năng chịu ruồi đục thân, chống đổ khá Giống ĐT26 thích hợp nhất trong vụ đông và vụ xuân và có thể nhân hạt ở vụ hè Năng suất đạt trung bình ở độ ẩm 12% là 22-28 tạ/ha tùy thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh Trong điều kiện thâm canh cao, ở diện tích hẹp, năng suất có thể đạt tới 30-32 tạ/ha Trong nghiên cứu này giống đậu tương ĐT26 là giống định hướng cải biến di truyền tạo cây đột biến và ứng dụng phát triển Giống Maverick (Mr) là vật liệu bổ sung dùng để kiểm tra qui trình chuyển gen đậu tương và giống William82 (WL 82) dùng cơ sở so sánh trình tự gen đích của giống đậu tương thí nghiệm
- Chủng vi khuẩn A rhizogenes K599 mang một trong hai cấu trúc chuyển gen pFGC/gfp, pZY102/gus và khuẩn A tumefaciens AGL1 mang hệ thống vector chuyển gen CRISPR/Cas9 được dùng trong nghiên cứu do phòng Công nghệ tế bào thực vật- Viện Công nghệ sinh học cung cấp
- Vector HBT-pcoCas9 được cung cấp từ phòng thí nghiệm Jen Sheen (RRID: Addgene_52254), vector pBlu/gRNA được cung cấp từ phòng thí nghiệm của Robert Stupar (RRID: Addgene_59188) và vector pFGC5941 (RRID: Addgene_84084) được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm của giáo sư Stacey, Đại học Missouri-Columbia, Hoa Kỳ
công ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ, Việt Nam)
- Trang thiết bị máy móc: nồi hấp khử trùng, máy cất nước 2 lần, tủ âm (-4 đến -200 C), tủ cấy, máy đo pH, máy ly tâm, máy PCR, pippet các loại buồng sinh trưởng, nhà lưới, vườn ươm
- Môi trường và hóa chất: các loại môi trường cơ bản: MS, YEP Các hoa chất cơ bản: BAP, IAA, GA3
2 2 Nội dung nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu gồm 6 nội dung:
Nội dung 1: Thiết kế hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 nhằm gây tạo đột biến gen GmGOLS trên đậu tương
Nội dung 2: Phát triển hệ thống cảm ứng rễ tơ thông qua vi khuẩn A Rhizogenes trên một số giống đậu tương Việt Nam, kiểm tra hoạt động của cấu trúc chuyển gen và chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9
Nội dung 3: Tạo cây đậu tương mang đột biến gen mã hóa Galactinol synthase thông qua hệ thống CRISPR/Cas9
Nội dung 4: Phân tích sự di truyền của các đột biến định hướng và gen chuyển
Nội dung 5: Phân tích sinh trưởng phát triển và thành phần hạt của các dòng đậu tương mang đột biến định hướng
Nội dung 6: Kiểm tra đột biến ngoài định hướng và lựa chọn dòng đột biến tiềm năng không mang gen chuyển
2 3 Phương pháp nghiên cứu