đậu tương
Đối với hệ rễ tơ hình thành từ cấu trúc mang gen chỉ thị gus sẽ được ngâm trong dung dịch X- Gluc và đặ t trong tủ ổn nhi ệt 37ºC qua đêm theo phương pháp củ a Jefferson và đồ ng tác gi ả [88] Biểu hiện màu GUS (xanh lam) được quan sát, thống
kê và ch ụp ảnh lưu giữ Biể u hi ệ n c ủa gen gfp được ki ể m tra b ằ ng cách soi tr ự c ti ế p bằ ng kính hiể n vi hu ỳnh quang (Oplympus- U-SPT (Japan-SZ X 12) ), đoạ n r ễ tơ chứ a c ấ u trúc chuyể n gen s ẽ phát sáng, độ phát sáng tùy thu ộc vào bi ể u hi ệ n c ủa gen gfp
Các dòng r ễ tơ in vitro được tách chi ế t DNA genome theo phương pháp CTAB c ủ a Doyle và cộ ng sự (1991)
Cặp mồi đặc hiệu Bar-F (5’-TACCATGAGCCCAGAACGACGCCC-3’); Bar-R (5’-TACCATGAGCCCAGAACGACGCCC- 3’) được s ử d ụng ki ể m tra sự có
mặt của gen chọn lọc bar và cặp mồi Cas9-F (5’-
GCCCAAGAGGAACAGCGATAAGC-3’); Cas9-R (5’-CAGTTCGCCGGCA GAGGCCAGC- 3’) được sử dụng để kiể m tra s ự có mặ t c ủa gen mã hóa protein Cas9 trong c ấ u trúc chuyể n gen có trong r ễ tơ in vitro
Sản phẩm PCR được được kiểm tra và phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%
2 3 4 Xác định và phân tích đột bi ến định hướng trên các gen đích củ a các dòngrễ tơ đậu tương rễ tơ đậu tương
gen GmGOLS03: G03F/R (5’-TGACGGAAATGGCCATGCTCCTG-3’/5’- CCCCGTATATCTCCATGGCTTGG-3’) và gen GmGOLS 19: G19F/R(5’-
TCTTGATTGAGTAAGGTGTGAG-3’/5’-GCGCCAGAGCATGGCAAGGAC- 3’) Sả n ph ẩ m khu ếch đại được điệ n di trên gel agarose 1% ho ặ c sử dụng cho phân tích bi ế n tính h ồ i tính trên gel polyacrylamide 15% theo phương pháp của Zhou và c ộng sự (2014) [89] C ụ thể , các mồi đặc hiệu cho gen GmGOLS03 hoặc GmGOLS19
sẽ được dùng để khuếch đại các dòng có thể mang đột biến và dòng không mang đột biến (WT) Thông qua phương pháp biến tính hồi tính hỗn hợp sản phẩm PCR của các dòng đột biến và WT, các DNA sợi đơn của dòng đột biến và WT sẽ sự kết hợp như Hình 2 2 A, kết quả xuất hiện băng vạch khi điện di trên gel polyacrylamide 15% (Hình 2 2 B)
Phương thức tiến hành như sau: (1) PCR độc lập các mẫu mẫu DNA của dòng đậu tương mang gen đột biến và dòng không mang đột biến (WT) (2) Trộn sản phẩm PCR của WT với mỗi dòng đột biến tỉ lệ 1:1 (3) Biến tính hỗn hợp nhiệt độ 950C trong 5 phút, sau đó hạ nhiệt độ về nhiệt độ phòng (4) Phân tích sản phẩm trên gel polyacrylamide 15%
Hình 2 1 Sơ đồ minh họa nguyên lý kỹ thuật biến tính hồi tính dùng trong sàng lọc
đột biến gen
A Minh hoạ các sự bắt cặp của các sợi đơn DNA của dòng đột biến và WT khi xử lý biến tính và hồi tính nhiệt; B Minh họa sản phẩm biến tính và hồi tính trên bản gel
polyacrylamide 15%, vạch màu thể hiện các điểm đột biến trên DNA
Sản phẩm PCR gen đích của các dòng rễ tơ tiếp tục được tinh sạch và chuyển sang vector nhân bản pJET1 2 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) để giải trình tự bằng hệ thống ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer với bộ giải trình tự
chu trình Applied Biosystems Big Dye Terminator (Ứng dụng Biosytems, Foster City, CA, USA) tại Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội, Việt Nam