Tiến hành sàng lọc các gen chuyển từ thế hệ T0 đến T2 bằng phương pháp phết thuốc diệt cỏ trên lá, kết hợp phân tích PCR mẫu DNA để khẳng định sự di truyền gen bar, kết quả sàng lọc thể hiện tại Bảng 3 3 và Hình 3 29 Ở thế hệ T1, tất cả 29 mẫu cây T1 của dòng DT1 1 được sàng lọc đều cho kết quả kháng thuốc diệt cỏ, đồng thời cho kết quả dương tính khi phân tích bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu pcoCas9 và 35SPPDK (Bảng phụ lục 1), điều này đã khẳng định sự có mặt của gen
chuyển Bên cạnh đó, một số cây T1 có nguồn gốc từ các dòng chuyển gen M3 1 và M4 1 cho kết quả đối lập, từ đó khẳng định các cây T1 này có kiểu gen không mang gen chuyển
Đối chứng
Hình 3 29 Xác định các dòng đột biến không mang gen chuyển
Tiếp tục sàng lọc thế hệ T2 của dòng DT1 1, chúng tôi xác định được dòng DT1 1-7-1, có kiểu gen đột biến GmGOLS kép và dòng DT1 1-7-2 mang đột biến đơn của gen GmGOLS03 đều không mang gen kháng thuốc trừ cỏ Tất cả các cây T3 được tạo ra từ hai dòng đột biến này đều mẫn cảm với thuốc diệt cỏ Kết quả phân tích PCR cũng cho thấy không có sự biểu hiện gen bar và gen Cas9 trong mẫu DNA của các cây T3 Điều này khẳng định, cấu trúc chuyển gen đã phân ly khỏi các dòng đột biến ở thế hệ T2 và T3
Từ các kết quả phân tích trên, chúng tôi đã lựa chọn được các dòng đột biến tiềm năng dạng đồng hợp tử, có hàm lượng đường họ raffinose trong hạt thấp, không mang gen chuyển và không chứa các đột biến ngoài mục tiêu Các dòng đột biến triển vọng này là nguồn nguyên liệu quan trọng cho công tác chọn tạo giống đậu tương Việt Nam theo định hướng nâng cao chất lượng hạt trong tương lai
CHƯƠNG 4 THẢO LUẬN
So sánh với các công trình trước đây trong cùng lĩnh vực và hướng nghiên cứu, chúng tôi thấy được những phát hiện mới, những đóng góp khoa học từ kết quả nghiên cứu trong luận án này Các thông tin này được chúng tôi thảo luận kỹ trong các phần dưới đây:
4 1 Hiệu quả chuyển gen và chỉnh sửa gen của hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ trên các giống đậu tương Việt Nam
Việc chuyển gen bền vững và ổn định vào cây đậu tương thường sử dụng nguyên liệu là lá mầm và đỉnh sinh trưởng Tuy nhiên, hiệu quả của phương pháp này không cao, đòi hỏi có một quy trình tối ưu và cần nhiều thời gian, chi phí để hoàn thiện một quy trình và tạo được cây đậu tương chuyển gen Do đó, hệ thống rễ tơ được xem là phương pháp hiệu quả trong các nghiên cứu về quá trình cộng sinh, khả năng hấp thu dinh dưỡng, tương tác với tác nhân gây bệnh và đặc biệt trong nghiên cứu chức năng gen hay chỉnh sửa gen trên đậu tương
Kết quả xây dựng hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ và chuyển gen vào rễ tơ trên một số giống đậu tương nghiên cứu được trình bày ở mục 3 2 1 So với nghiên cứu của Chen và đồng tác giả năm 2018, lá mầm đậu tương 5 ngày tuổi bao gồm cuống lá dài 0,5 cm được sử dụng làm nguyên liệu biến nạp [81] Tỉ lệ cảm ứng tạo rễ tơ của các giống đậu tương trong nghiên cứu này đạt 90-99% Tuy nhiên, hiệu suất chuyển gen chỉ đạt từ 30-60% Tương tự như vậy, khi mầm 5 ngày tuổi được sử dụng trong biến nạp gen gfp trong công bố của Keyes và đồng tác giả năm 2009, tỉ lệ cảm ứng tạo rễ tơ chỉ đạt 45%, trong đó số rễ tơ mang và biểu hiện gen chuyển chỉ đạt khoảng 55% [94]
Phương pháp cảm ứng tạo rễ tơ trong điều kiện in vitro với vật liệu là lá mầm 3 ngày tuổi của các giống đậu tương Việt Nam, chúng tôi đã thu được tỉ lệ chuyển gen cao nhất là 79,8% với giống ĐT26 khi sử dụng cấu trúc mang gen gfp Tỉ lệ cảm ứng tạo rễ tơ cũng đạt trên 90% với giống đậu tương này Phương pháp này đã cho kết quả biểu hiện gen trong thời gian ngắn hơn giúp giảm thiểu thời gian và chi phí cho việc kiểm tra hoạt động của các cấu trúc chuyển gen
qua hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ trên đậu tương trong các nghiên trước đây Jacobs và đồng tác giả sử dụng hệ thống này để tạo đột biến gen ngoại lai (gfp) ở rễ tơ trên giống đậu tương Jack và ghi nhận tỉ lệ đột biến khoảng 95% [80] Trong khi đó, Cai và đồng tác giả đã thành công trong gây tạo đột biến hai gen trong hệ gen đậu tương với tỉ lệ chỉnh sửa gen dao động từ 1,3% tới 30% [59] Trong nghiên cứu của chúng tôi được trình bày ở mục 3 2 2, cấu trúc CRISPR/Cas9 được thiết kế theo định hướng tạo đột biến trên hai gen GmGOLS03 và GmGOLS19 trong hệ gen đậu tương Toàn bộ mẫu rễ tơ được kiểm tra đều xuất hiện băng vạch DNA sai khác khi phân tích đột biến thông qua điện di, khẳng định hiệu quả chỉnh sửa hệ gen rất cao thông qua cảm ứng tạo rễ tơ trên giống đậu tương ĐT26
4 2 Việc lựa chọn trình tự mục tiêu trong thiết kế cấu trúc chỉnh sửa gen trên đậu tương
Đã có nhiều nghiên cứu thành công trong việc sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 có cùng một gRNA định hướng gây đột biến đồng thời hai hoặc nhiều gen tương đồng trên một số dòng cây đa bội [80] [58], đặc biệt ứng dụng thành công ở đậu tương điển hình như nghiên cứu của Yo và cộng sự (2020) đã chỉnh sửa đa gen (GmF3H1, GmF3H2 và GmFNSI ‐1) nhằm cải thiện hàm lượng isoflavone và khả năng kháng virus khảm [67] hay nghiên cứu loại bỏ gen GmJAG1 thực hiện bởi nhóm nghiên cứu của Zhandong Cai (2021) nhằm cải tạo tính chống chịu nhiệt tăng năng suất giống đậu tương Huachun 6 trồng ở khu vực có vĩ độ thấp [65] Căn cứ trên cơ sở khoa học của các nghiên cứu trước đây ở lúa gạo, cà chua và đậu tương, chúng tôi đã phát triển phức hệ gRNAs kép có khả năng tạo ra các vết cắt lớn, với độ chính xác cao đảm bảo loại bỏ đúng đoạn gen mục tiêu, đồng thời có thể dễ dàng xác định kết quả thông qua phương pháp điện di trên gel [87] [95-96] Với những tiêu chí này, chúng tôi đã lựa chọn và xác định được một đoạn trình tự ngắn với vị trí nhắm sát 2 đoạn gen mục tiêu
GmGOLS03 và GmGOLS19 Các vị trí mục tiêu này được đảm bảo giống hệt nhau và được giới hạn bởi ở vùng exon 2 trong cả hai gen đã chọn Các vị trí được nhắm mục tiêu được thiết kế mang 23-25 cặp base, tương đối ngắn so với các nghiên cứu trước đây đã sử dụng các gRNA kép để phân cắt các vị trí mục tiêu ở khoảng cách xa Kết quả là khoảng cách ngắn giữa các vị trí phân cắt đã làm tăng độ cắt chính xác của protein Cas9 Kết quả nghiên cứu được trình bày trong mục 3 3 3 của luận án
GmGOLS03 và 63,3% đối với gen GmGOLS19 ở ba dòng chuyển gen thế hệ T0 (Hình 3 14) Trong khi đó, với đoạn trình tự mục tiêu chứa ít hơn 5 nucleotide thì chỉnh sửa gen giảm mức rất thấp, chỉ đạt 3,3% ở gen GmGOLS03 và 10% ở gen
GmGOLS19; kết quả này phù hợp các báo cáo trước đó [97-98] Kết quả nghiên cứu của luận án một lần nữa khẳng định tầm quan trọng của việc lựa trình tự cắt cách mục tiêu (target) đối với các vị trí cắt đồng thời trong việc chỉnh sửa gen bằng hệ thống CRISPR/Cas9
4 3 Khả năng xuất hiện đột biến định hướng muộn thông qua hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9
Thông thường, khi cấu trúc chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 được chuyển vào tế vào thực vật, họat động của hệ thống này sẽ gây tạo đột biến định hướng Các đột biến này có thể được phát hiện và xác định ở các dòng cây tái sinh Tuy nhiên, việc tồn tại và hoạt động của hệ thống chỉnh sửa gen trong tế bào cây chủ có thể gây tạo các đột biến ở giai đoạn tiếp theo, thậm chí là ở các thế hệ tiếp theo của các dòng cây mang cấu trúc chỉnh sửa gen Điều này được chúng tôi phát hiện và phân tích trong nghiên cứu này, kết quả được thể hiện trong mục 3 4
Đối với dòng đột biến DT1 1, tất cả các alen tìm thấy ở thế hệ T1 đều được quan sát thấy ở thế hệ T0 (Hình 3 14 và 3 16) Ngoài ra, những đột biến này được di truyền ổn định sang thế hệ T2 Tuy nhiên, đối với giống Marverick các cây T1 có nguồn gốc từ cây dòng chuyển gen thế hệ T0 dòng M3 1 và dòng M4 1 lại mang một số alen đột biến không được tìm thấy ở thế hệ T0 (Hình 3 14 và 3 16) Chứng tỏ, trên cây đậu tương việc chỉnh sửa gen tạo bằng CRISPR/Cas9 tạo được đột biến ở thế hệ T0, nhưng không phải lúc nào các đột biến của thế hệ T0 cũng di truyền sang thế hệ T1, kết quả nghiên cứu của luận án giống với kết quả nghiên cứu của Kanazashi và Kurtin đã công bố [58] [99] Các mâu thuẫn trong kết quả của luận án có thể do sự hoạt động CRISPR xảy ra một cách độc lập muộn trong giai đoạn phát triển của cây T0, tạo ra đột biến khảm ở một số mô dùng phân tích và những mô khác cũng có nhưng chưa được xác định Và các đột biến trong các mô chưa xác định có thể được di truyền ở các cây T1 Hiện tượng này trước đây đã được Kanazashi và cộng sự chứng minh, trong đó phân tích DNA của từng mẫu riêng lẻ được thực hiện và các alen quan sát được của chúng phù hợp với các hạt mang đột biến [58] Phương pháp này có thể ứng dụng để nghiên cứu chỉnh sửa bộ gen trên đậu tương và một số loài
thực vật phức tạp khác trong tương lai
4 4 Đột biến gen GmGOLS và sự nảy mầm của hạt đậu tương
RFOs được chứng minh còn có vai trò trong sự nảy mầm hạt do năng lượng từ carbonhydrat dự trữ trong hạt được cho là cần thiết cho sự nảy mầm Cụ thể là các nhà khoa học đã kiểm tra sự nảy mầm của hạt đậu khi bỏ sự trao đổi raffinose and stachyose, kết quả là sự nảy mầm đã bị chậm đáng kể [18]; nghiên cứu của Obendorf chỉ ra rằng các dòng đậu tương có lượng raffinose, stachyose, và phytin thấp nhạy cảm với nhiệt độ thấp, ẩm [100] Một số nghiên cứu về thực vật có hàm lượng cao raffinose trong điều kiện sinh trưởng bình thường đã cho thấy khả năng chịu hạn và chịu lạnh cao hơn các loại cây hoang dại [101-102] Ví dụ như ở cây Arabidopsis, sự tích lũy của raffinose rất quan trọng đối với stress khô hạn để duy trì vách tế bào và ổn định protein tế bào [37] Tuy nhiên, trong nghiên cứu của Dierking và Bilyeu đánh giá sự nảy mầm của hạt bằng các phương pháp khác nhau với nước hoặc DGJ, kết quả đã chỉ ra sự giảm hàm lượng RFOs không ảnh hưởng đáng kể sự nảy mầm của hạt đậu tương [103] Cùng kết quả thí nghiệm về tỉ lệ nảy mầm hạt đậu tương dòng SGUL có hàm lượng raffinose và stachyose siêu thấp là 83% so với dòng đậu tương chứa hàm lượng raffinose and stachyose trung bình là 100% [57] Điều này chứng tỏ RFOs không phải là nguồn năng lượng thiết yếu trong quá trình nảy mầm của hạt đậu tương
Trong nghiên cứu này của luận án, một thí nghiệm về độ nảy mầm trong môi trường nước đã được thực hiện, kết quả được trình bày trong mục 3 5 2 Hạt của cây đột biến có hàm lượng đường sucrose và raffinose thay đổi cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về sức sống của hạt so với hạt giống của cây đối chứng Kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy những thay đổi trong thành phần đường có trong hạt đậu tương của các dòng đột biến GmGOLS không ảnh hưởng đến sức khỏe và khả năng nảy mầm của hạt, kết quả này phù hợp với các nghiên cứu đã được công bố
4 5 Đột biến gen GmGOLS ảnh hướng đến sự thay đổi của hàm lượng cacbohydrat có trong hạt
Các kết quả nghiên cứu khoa học trước đây đã chỉ ra rằng đột biến tự nhiên hay tác động vào RNA trung gian tạo nên sự bất hoạt của nhóm gen tổng hợp raffinose synthase ở cây đậu tương đã làm hàm lượng RFOs ở mức thấp [14-15] [104] Trong nghiên cứu của luận án, hai gen GmGOLS mã hóa cho galactinol synthase - một loại
enzyme đầu tiên tham gia vào quá trình sinh tổng hợp raffinose trong và có vai trò quan trọng trong con đường chuyển hóa RFOs [31] [105] bị gây đột biến bởi hệ thống CRISPR/Cas9 Kết quả nghiên cứu được chúng tôi trình bày ở mục 3 5 3 cho thấy: hạt của các dòng đậu tương mang đột biến GmGOLS có tổng hàm lượng RFOs giảm so với hạt của cây đối chứng không mang đột biến Thành phần của RFOs (như: raffinose, sucrose, stachyose, verbascose ) có sự thay đổi Cụ thể là hàm lượng raffinose tăng lên đến 65% trong khi stachyose và verbascose đều giảm tới 45% Trong hạt đậu tương, stachyose là thành phần chính của RFOs, thế nên ở các dòng mang đột biến gen GmGOLS có tổng lượng RFOs trong hạt giảm 30,2% ở thể đột biến đơn và 35,2% ở thể đột biến kép Ngoài ra, đối với những dòng mang đột biến kép (gen GmGOLS03 và gen GmGOLS19) có hàm sucrose giảm một cách đáng kể, nhưng đối với đột biến đơn gen GmGOLS03 lại không cho kết quả tương ứng
Dòng đậu tương PI 200508 được biết đến như dòng đậu tương điển hình có hàm lượng stachyose và raffinose thấp [104] Sử dụng dòng này, Dierking và Bilyeu đã chứng minh raffinose synthase 2 (RS2) là gen có mang alen PI200508 [14], việc loại bỏ RS2 đã làm giảm hàm lượng stachyose ba lần và giảm 5 lần lượng raffinose cũng như tăng 50% hàm lượng sucrose trong hạt của cây trồng trong nhà kính [15] Trong nghiên cứu này chúng tôi nhận thấy việc đột biến gen GmGOLS gây ảnh hưởng lớn đến sự tích tụ đường sucrose, raffinose và stachyose Đáng ghi nhận nhất là sự gia tăng hàm lượng của đường raffinose, và sự giảm đồng thời hàm lượng stachyose, điều cho thấy mối liên hệ giữa chức năng của GmGOLS và rafinose tuy chưa rõ ràng nhưng điều này đã được các nhà khoa học lưu tâm trước đó Các nghiên cứu trong tương lai hứa hẹn sự giải thích rõ hơn về mối tương quan của hàm lượng các carbohydrate được tạo ra theo phương thức chuyển gen với một số chất trung gian như myo-inositol và galactinol và có thể kết hợp kiểu gen gây bệnh được biết đến
Khi chúng tôi so sánh về RFOs có nguồn gốc từ các dòng mang đột biến đơn gen GmGOLS03 và đột biến kép (GmGOLS03, GmGOLS19) đã nhận thấy một số khác biệt kiểu hình có thể được cho là do GmGOLS19 mất chức năng Tuy nhiên không có sự khác biệt về hàm lượng RFOs của hai dạng đột biến trên Tổng hợp các dữ liệu nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy rằng gen GmGOLS03 có thể có những ảnh hưởng quan trọng hơn đối với sự tổng hợp RFOs Ở các dòng đột biến hàm lượng RFOs vẫn được tạo ra một lượng đáng kể trong hạt, điều này có thể giả định do hoạt
tính của enzyme Galactinol synthase vẫn hoạt động, do enzyme này được mã hoá bởi các gen khác thuộc nhóm gen GmGOLS có biểu hiện trong hạt Cụ thể là
Glyma 19G227800 và Glyma 10G145300 Ý tưởng loại bỏ bổ sung các gen này (trong nền đột biến kép của chúng tôi) dự kiến sẽ tạo sự tác động đáng kể đến kiểu hình trong sinh tổng hợp RFO
4 6 Tiềm năng trong chọn tạo giống đậu tương trong nước thông qua hệ thống chỉnh sửa hệ gen
Đậu tương là cây trồng có khả năng chỉnh sửa và biến đổi gen hiệu quả Các báo cáo trước đây cho thấy những thành công về chuyển gen chỉ đạt ở một số giống đậu tương nhất định như William 82, Jack, Thorne và Mr [97] [106-107] Trong luận án này chúng tôi đã thành công trong việc tạo giống đậu tương biến đổi gen bằng kỷ