Nghiên cứu đồng ruộng đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn [55].
Các dòng lạc nghiên cứu và giống đối chứng đƣợc trồng riêng trong cùng một điều kiện và chế độ chăm sóc. Các dòng lạc nghiên cứu đƣợc trồng theo hàng, chia ô, gắn nhãn để tiện cho việc theo dõi và lấy số liệu.
Thời vụ: Các dòng lạc nghiên cứu thế hệ thứ Năm đƣợc trồng vào vụ thu đông 2010 (từ 8/2010 – 12/2010), thế hệ thứ Sáu đƣợc trồng vào vụ xuân 2011 (từ 2/2011 – 7/2011).
Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học ở giai đoạn thu hoạch của các dòng và giống gốc về các chỉ tiêu:
- Chiều cao thân chính
- Số nhánh/cây - Số quả/cây - Số lƣợng quả chắc/cây - Khối lƣợng 100 quả - Khối lƣợng 100 hạt - Tỷ lệ nhân 2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng hạt 2.2.3.1. Xác định hàm lượng lipid
Dựa vào tính chất hòa tan của dung môi hữu cơ để chiết lipid. Lipid đƣợc chiết trực tiếp với petroleum ether ở 4o
C. Hàm lƣợng lipid đƣợc tính bằng hiệu số
của khối lƣợng mẫu trƣớc và sau khi chiết [13].
2.2.3.2. Xác định hàm lượng protein
Hàm lƣợng protein tan xác định theo phƣơng pháp Lowry đƣợc mô tả trong
tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và đtg (1998) [3]. Dựa vào cƣờng độ màu xanh
của phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden - photphovonphramat (thuốc thử Folin – Ciocalteau) để xác định khối lƣợng protein. Chiết protein bằng
đệm photphat citrat (pH=10), để qua đêm ở 4o
C, ly tâm 12,000 vòng/phút trong 20 phút, thu lấy dịch. Đo hấp phụ quang phổ trên máy UV ở bƣớc sóng 750nm với thuốc thử Folin – Ciocalteau.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.4. Khả năng chịu hạn của các dòng lạc đƣợc đánh giá ở giai đoạn hạt nảy
mầm bằng phƣơng pháp gây hạn sinh lý
2.2.4.1. Chuẩn bị mẫu
Hạt lạc sau khi bóc vỏ gỗ đƣợc ngâm nƣớc 2 giờ, sau đó ủ ẩm bằng dung dịch sorbitol 7%. Hạt nảy mầm sau các khoảng thời gian ủ 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày đƣợc lấy để xác định hoạt độ của α – amylase, hàm lƣợng đƣờng khử, hoạt độ của protease, hàm lƣợng protein tan. Đối chứng là hạt lạc đƣợc ủ bằng nƣớc cất, không chứa sorbitol 7%.
2.2.4.2. Xác định hoạt độ của α - amylase
Sử dụng đệm photphat 0,2M (pH=6,8) để chiết α - amylase. Hoạt độ của
enzyme đƣợc xác định thông qua lƣợng tinh bột bị thủy phân ở 30o
C trong 30 phút dựa vào đồ thị chuẩn tinh bột với giá trị OD đo ở bƣớc sóng 560nm [5].
Định tính hoạt độ của α - amylase bằng phƣơng pháp khuếch tán trên thạch với cơ chất là tinh bột 1%.
2.2.4.3. Xác định hàm lượng đường tan bằng phương pháp vi phân tích
Xác định hàm lƣợng đƣờng tan dựa trên nguyên tắc: Trong môi trƣờng kiềm, đƣờng khử kaliferixianua thành kaliferoxianua. Với sự có mặt của gelatin, kaliferoxianua kết hợp với sắt sunphat axit tạo thành phức chất màu xanh bền. Hỗn hợp thu đƣợc đo trên máy ở bƣớc sóng 585 nm [3].
2.2.4.4. Xác định hoạt độ của enzyme protease
Hoạt độ protease xác định bằng phƣơng pháp Anson cải tiến theo mô tả của Nguyễn Văn Mùi (2001) [13]. Sử dụng đệm photphat pH=6,5 để chiết protease. Xác định hoạt độ của enzyme trên cơ sở định lƣợng sản phẩm tạo ra trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteau. Hoạt độ enzyme đƣợc tính dựa trên đồ thị đƣờng chuẩn xây dựng bằng tyrozin với giá trị OD đo ở bƣớc sóng 750nm
Định tính hoạt độ của protease: Tiến hành tƣơng tự nhƣ định tính hoạt độ α- amylase, cơ chất là cazein 1%.
2.2.4.5. Xác định hàm lượng protein tan
Hàm lƣợng protein tan ở giai đoạn hạt nảy mầm đƣợc xác định nhƣ mô tả ở mục 2.2.3.2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.5. Phƣơng pháp sinh học phân tử
2.2.5.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Sử dụng lá non của cây lạc để tách chiết DNA tổng số theo phƣơng pháp của Gawel và đtg, 1991 có cải tiến [30]. Hóa chất sử dụng tách chiết DNA: Tris HCl 1M, pH=8,0; NaCl 5M; EDTA 0,5M; CTAB 4%; Isopropanol; Ethanol; Sorbitol
2M; Cloroform: isoamyl (24: 1); NaH2PO40,4%; nƣớc cất.
2.2.5.2. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số
DNA tổng số đƣợc định lƣợng và kiểm tra độ tinh sạch bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp phụ và điện di trên gel agarose 1%.
2.2.5.3. Phương pháp nhân gen cystatin bằng kỹ thuật PCR
DNA tổng số thu đƣợc sử dụng để nhân gen cystatin bằng kỹ thuật PCR. Cặp mồi CysAra F/CysAra R đƣợc thiết kế dựa trên trình tự nucleotide gen cystatin do Yan và đtg công bố tại ngân hàng gen quốc tế với mã số AY723693 [57].
CysAra F 5’ATGGCAGCAGTGGGTGCA 3’
CysAra R 5’ TTAAGCATTGGAGCCATCAC 3’
Phản ứng PCR đƣợc tiến hành trong hỗ hợp gồm: PCR Master mix 12,5μl; Mồi (10pmol/μl ) 2μl; DNA tổng số (50ng/μl ) 2μl; Nƣớc khử ion vừa đủ 25 μl.
Hỗn hợp đƣợc thực hiện với 30 chu kỳ phản ứng, gồm các giai đoạn: 94o
C/3 phút; 94oC/30 giây; 56oC/1 phút; 72oC/1 phút; 72oC/10 phút và lƣu giữ sản phẩm ở 4o
C. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, sau đó tinh sạch (thôi gel) theo bộ kit AccuPrep PCR Purification của hãng Bioneer.
2.2.5.4. Phương pháp tách dòng gen
Tạo plasmid tái tổ hợp
Sản phẩm PCR đã tinh sạch đƣợc gắn vào vector pTZ 57R/T của hãng
Invitrogen. (hình 2.2). Thành phần phản ứng gồm: Sản phẩm PCR 4 μl; Vector pTZ57R/T 1μl; Đệm T4 2μl; T4 ligase 0,8μl; Nƣớc khử ion vừa đủ 25μl. Hỗn hợp trên đƣợc ủ ở 22oC trong 1 giờ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.2. Vector pTZ57R/T
Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α
Vector tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α.
Các khuẩn lạc E. coli chứa vector tái tổ hợp mang sản phẩm PCR đƣợc chọn lọc
trên môi trƣờng LB đặc chứa ampicillin và IPTG.
Kiểm tra sản phẩm chọn dòng (Colony – PCR)
Kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng colony - PCR với dịch nuôi vi khuẩn, sử dụng cặp mồi CysAra F/CysAra R. Chu trình nhiệt của colony – PCR giống phản ứng PCR. Sản phẩm colony – PCR chọn dòng đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1%.
Tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp
Tách DNA plasmid tái tổ hợp bằng bộ kit tách plasmid của hãng BIONEER
(AccuPrep™ Plasmid Mini Extraction Kit).
Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp
DNA plasmid tái tổ hợp sau khi đƣợc tách chiết, đƣợc cắt kiểm tra bằng 2 loại enzyme giới hạn: EcoRI và BamHI. Thành phần phản ứng cắt gồm: DNA plasmid 1μl; EcoRI 1μl; BamHI 1μl; Buffer 2μl; Nƣớc khử ion vừa đủ 15 μl. Ủ hỗn hợp sản phẩm trên ở 37oC trong 3 giờ. Sau đó kiểm tra sản phẩm cắt trên gel agarose 1%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.5.5. Phương pháp xác định trình tự gen bằng máy đọc tự động
Trình tự của gen cystatin đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyner (Applied Biosystem) sử dụng
bộ hóa chất sinh chuẩn BigDye®
Terminator v3.1 cycle sequencing với bộ mồi có
gắn huỳnh quang
2.2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu thống kê theo phƣơng pháp phân tích hàng loạt trên máy tính
bằng phần mềm excel theo hƣớng dẫn của Chu Hoàng Mậu (2008) với các trị số: Trung bình mẫu (X_ ), phƣơng sai (2), độ lệch chuẩn ( ), sai số trung bình mẫu (
_
S x), hệ số biến động Cv%, hệ số tƣơng quan R với n < 30.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM NÔNG HỌC VÀ CHẤT LƢỢNG
HẠT CỦA MỘT SỐ DÕNG LẠC NGHIÊN CỨU
3.1.1. Đặc điểm nông học của một số dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm
Các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc và chiếu xạ đƣợc trồng vào vụ Thu Đông năm 2010. Vụ lạc thu đông cung cấp nguồn giống chất lƣợng cao cho vụ Xuân. Đồng thời góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế cao hơn so với các cây trồng khác (khoai lang, ngô, đậu tƣơng). Tuy nhiên, do khung thời vụ hẹp, khí hậu không thuận, lƣợng mƣa ít, bệnh hại xuất hiện sớm
và gây hại nặng đã gây khó khăn cho việc sản xuất lạc [56]. Kết quả đánh giá các
đặc điểm nông học của các dòng lạc thế hệ thứ Năm thông qua các chỉ tiêu về chiều cao cây, số nhánh/cây, số quả/cây đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Một số đặc điểm nông học của các dòng lạc ở thế hệ thứ Năm
Chỉ tiêu
Dòng
Chiều cao
thân chính (cm) Số nhánh/cây Số quả/ cây
X S X Cv% X SX Cv% X SX Cv% RM5.46 43,47 0,76 6,73 5,58 0,15 9,22 27,40 1,56 18,06 RM5.47 42,20 0,55 5,00 5,08 0,18 12,62 29,55 1,33 14,94 RM5.48 36,86 1,09 11,05 5,79 0,21 13,86 30,09 1,34 14,82 RM5.49 33,73 0,73 8,42 6,80 0,22 12,67 22,92 0,93 14,63 R5.44 39,17 0,81 7,13 8,56 0,18 6,16 41,73 1,73 13,73 R5.46 43,53 1,08 9,58 6,93 0,15 8,56 22,53 0,79 13,61 R5.48 30,75 0,51 5,75 5,15 0,15 10,76 15,30 0,42 8,74 L18 30,18 0,89 9,81 8,09 0,31 12,91 25,36 1,04 8,40
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chiều cao của thân cây lạc phụ thuộc vào đặc điểm di truyền của giống và
điều kiện ngoại cảnh [4]. Ở một mức độ nhất định, chiều cao thân chính có thể là
chỉ tiêu để đánh giá tốc độ sinh trƣởng và khả năng cho năng suất của cây lạc [18].
Bảng 3.1 cho thấy các dòng lạc nghiên cứu đều có chiều cao thân chính cao hơn so
với giống gốc (cao hơn 30,18cm), dao động từ 30,75cm đến 43,53cm. Hai dòng lạc
có chiều cao thân chính đạt cao nhất là RM5.46 (43,47cm) và R5.46 (43,53cm). Sự
biến động di truyền về tính trạng chiều cao thân chính cây lạc ở thế hệ thứ Năm từ
5,00% đến 11,05%. Dòng RM5.48 có sự ổn định tính trạng chiều cao cây ở mức cao
nhất, hệ số biến động Cv = 11,05%. Có 6/7 dòng (chiếm 85,71%) có hệ số biến động nhỏ hơn giống L18 (Cv = 9,81%).
Số nhánh/cây liên quan trực tiếp đến số lƣợng quả trên cây và phụ thuộc khá
nhiều vào điều kiện ngoại cảnh [4], [18]. Bảng 3.1 cho thấy số nhánh/cây của các dòng dao động trong khoảng 5,08 nhánh/cây đến 8,56 nhánh/cây. Các dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc có số nhánh/cây cao hơn so với các dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc và xử lý chiếu xạ, dao động từ 5,15 nhánh/cây đến 8,56 nhánh/cây. Hầu hết các dòng lạc nghiên cứu đều có xu hƣớng giảm số nhánh/cây so với giống gốc. Sự biến động di truyền về số nhánh/cây của các dòng nghiên cứu còn cao, từ 6,16% đến 13,86%.
Số quả/cây có mối tƣơng quan thuận với số nhánh/cây và thay đổi theo từng dòng và nguồn gốc mỗi dòng. Các dòng nghiên cứu có số quả/cây dao động trong khoảng 15,30 quả/cây đến 41,73 quả/cây. Trong đó có bốn dòng có số quả/cây cao hơn so với giống gốc (cao hơn 25,36 quả/cây) là RM5.46, RM5.47, RM5.48 và
R5.44. Sự biến động di truyền về số quả/cây dao động từ 8,74% đến 18,06% và đều
cao hơn so với giống gốc (Cv = 8,40%).
Nhƣ vậy, các chỉ tiêu nông học (chiều cao thân chính, số nhánh/cây, số quả/cây) của các dòng nghiên cứu có sự khác nhau, tuy nhiên đây chỉ là những tính trạng ít liên quan đến khả năng chịu hạn [10]. Nhiều dòng lạc có mức độ biến động di truyền thấp hơn so với giống gốc, chứng tỏ đã có sự ổn định về các tính trạng nghiên cứu này.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Về năng suất quả: Các chỉ tiêu: số quả chắc/cây, khối lƣợng 100 quả, khối
lƣợng 100 hạt, tỷ lệ nhân có mối tƣơng quan thuận đến năng suất. Các chỉ tiêu trên phụ thuộc vào giống, dòng (kiểu gen), ngoài ra còn phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh, thời vụ gieo trồng, chế độ chăm sóc. Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu năng suất và chất lƣợng hạt của các dòng lạc thế hệ thứ Năm đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
Số quả chắc/cây của các dòng nghiên cứu dao động từ 11,60 quả chắc/cây đến 28,69 quả chắc/cây. Có 5/7 dòng có số quả chắc/cây nhiều hơn so với giống gốc
L18 (số quả chắc/cây = 15,82), chiếm 71,42%. Sự biến động di truyền về số quả
chắc/cây dao động từ 8,40% đến 16,24%. Tất cả các dòng đều có hệ số biến động cao hơn so với giống gốc (Cv = 8,40%).
Khối lƣợng 100 quả của các dòng từ 83,74 gram đến 122,38 gram. Hai dòng
có khối lƣợng 100 quả cao hơn so với giống gốc là RM5.46, R5.46. Có 5/7 dòng lạc
có khối lƣợng 100 quả nằm trong khoảng 106 - 155 gram, nhƣ vậy chúng thuộc nhóm quả to [7]. Mức độ biến động khối lƣợng 100 quả của các dòng dao động từ 4,05% đến 8,21% và đều cao hơn so với giống L18 (Cv = 1,43%).
Khối lƣợng 100 hạt dao động từ 42,77 gram đến 52,67 gram, có 3 dòng là RM5.46, R5.44 và R5.46 có khối lƣợng 100 quả cao hơn so với giống gốc L18 (47,85 gram). Sự biến động di truyền của các dòng về chỉ tiêu 100 hạt của các dòng lạc tƣơng đối thấp, trong khoảng 1,97% đến 6,54% và đều cao hơn so với giống lạc L18 (Cv = 1,90%).
Tỷ lệ nhân là tỷ lệ giữa khối lƣợng hạt và khối lƣợng quả. Đây là chỉ tiêu quan trọng, đánh giá năng suất của giống. Trong cùng một điều kiện ngoại cảnh, tỷ lệ nhân phụ thuộc vào chiều dày của vỏ quả, khả năng tích lũy vật chất khô trong hạt và chịu ảnh hƣởng lớn của giống [7]. Bảng 3.2 cho thấy, tỷ lệ nhân của các dòng dao động trong khoảng 64,08 % đến 72,80%. Hai dòng lạc R5.46, R5.48 có tỷ lệ nhân cao hơn giống gốc (cao hơn 70,55%). Sự biến động di truyền về tỷ lệ nhân, tƣơng đối thấp từ 2,77% đến 6,98%, chứng tỏ các dòng đã có sự ổn định về mức độ di truyền.
Nhƣ vậy, các dòng lạc đều có hệ số biến động di truyền về các chỉ tiêu cấu thành năng suất cao hơn so với giống gốc. Qua kết quả nghiên cứu và chọn lọc ở thế
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
hệ thứ Năm, chúng tôi thu đƣợc một số biến dị nổi bật, từ các dòng gồm:
Dòng R5.44 có số quả chắc/cây cao nhất, khối lƣợng 100 hạt cao hơn so với
giống gốc L18.
Dòng R5.46, RM5.46 có khối lƣợng 100 quả, 100 hạt lớn nhất. Dòng R5.46, R5.48 có tỷ lệ nhân đạt trên 70% và cao hơn giống gốc.
3.1.2. Chất lƣợng hạt của các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm
Đánh giá chất lƣợng hạt của các dòng lạc nghiên cứu thông qua xác định hàm lƣợng lipid và protein trong hạt. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
Hàm lƣợng lipid là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lƣợng hạt của các
cây lấy dầu. Hàm lƣợng lipid của các dòng lạc nghiên cứu dao động từ 34,95% đến
39,10%. Dòng lạc có hàm lƣợng lipid cao nhất là RM5.48 (39,10%). Dòng R5.46 có
hàm lƣợng lipid thấp nhất, đạt 34,95%. Đa số các dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc và mô sẹo chịu chiếu xạ kết hợp gây mất nƣớc của giống L18 có hàm lƣợng lipid cao hơn so với giống gốc (cao hơn 35,20%).
Hàm lƣợng protein trong hạt không một chỉ tiêu quan trọng đánh giá chất lƣợng và phẩm chất hạt mà còn liên quan đến khả năng chống chịu của cây trồng. Hàm lƣợng protein trong hạt tiềm sinh của các dòng lạc dao động từ 26,25% đến
38,11%. Dòng lạc có hàm lƣợng protein cao nhất là RM5.47 (38,11%). Dòng lạc có
