Tiêm nhũ dầu
Xuất hiện những giọt dầu có hình dạng như những không bào nằm xen kẽ ở giữa các sợi cơ, có hình tròn, elip với kích thước khác nhau. Ngày thứ 3 bắt đầu hình thành ổ viêm và huy động lượng lớn tế bào máu tập trung đến, nhất là xung quanh những giọt dầu. Vùng mô cơ tại trung tâm ổ viêm bị hoại tử nặng nhất và giảm dần về vùng ngoại vi của ổ viêm. Các sợi cơ quanh giọt dầu bị hoại tử hoàn toàn, tập trung khá nhiều các loại tế bào máu bắt màu đậm của Hematocylin. Các tế bào máu này chủ yếu là bạch cầu, rải rác có sự xuất hiện của các tế bào hồng cầu. Tuy nhiên, ổ viêm lại giảm mạnh dần về kích thước và số lượng các loại tế bào vào ngày thứ 7 và ngày thứ 14. Mô cơ ít bắt gặp giọt dầu, không còn hiện tượng hoại tử nghiêm trọng điều này cho thấy các giọt dầu đã được thực bào bởi các bạch cầu tham gia vào đáp ứng viêm. Đến ngày thứ 21, không còn sự hiện diện của ổ viêm cũng như xuất hiện giọt dầu nằm trong cơ.
Tiêm vắc xin không có nhũ dầu
Ổ viêm bắt đầu xuất hiện từ ngày thứ 7 sau khi tiêm vắc xin với kích thước khá nhỏ, không thể quan sát được bằng mắt thường trên tiêu bản. Quan sát thấy sự tập trung dày đặc của đại thực bào và các loại bạch cầu bắt màu tím của thuốc nhuộm Hematocyin. Diện tích ổ viêm tăng dần sau 14 và 21 ngày. Không xuất hiện những hình tròn, hình elip trong mô như khi tiêm nhũ dầu. Tuy nhiên, khoảng rỗng lớn ở trung tâm ổ viêm cũng lớn dần và bên trong chứa dịch rỉ viêm như khi tiêm các loại khác. Sự xuất hiện của ổ viêm sau khi tiêm vắc xin muộn hơn so với tiêm nhũ dầu. Ổ viêm có hình bầu dục với các lớp tế bào bao quanh tiêu diệt tác nhân gây bệnh và ngăn cách với vùng mô lành bằng một lớp không bào. Các lớp tế bào này có hình dạng và khả năng bắt màu thuốc nhuộm ở mức độ khác nhau. Ổ viêm bị cô lập với
Khóa luận tốt nghiệp - 2011 50 Đại học Nha Trang
vùng cơ bình thường xung quanh bằng các lớp tế bào này, nhằm không cho ổ viêm lan rộng và xâm nhập vào hệ tuần hoàn.
Các tế bào đại thực bào đơn nhân, kích thước lớn, bắt màu thuốc nhuộm nhạt. Đại thực bào được biệt hóa từ những bạch cầu đơn nhân và có nhiệm vụ chủ yếu là thực bào: bắt, nuốt và tiêu hoá các kháng nguyên lạ. Ngoài ra, đại thực bào còn có chức năng hóa ứng động bạch cầu, tăng tính thấm thành mạch, chức năng xử lý và trình diện kháng nguyên. Quá trình này chậm hơn thoát bạch cầu trung tính qua các khe hở giữa các tế bào nội mạc nên bạch cầu đơn nhân xuất hiện trong ổ viêm chậm hơn (Robert R.J, 2001). Đại thực bào đã hoạt hoá sau đó trở thành tế bào cố định của tổ chức. Lớp tiếp theo là các tế bào đang bị tiêu diệt, các mảnh vụn tế bào. Chủ yếu là bạch cầu trung tính sau khi tham gia quá trình thực bào sẽ bị thoái hóa, tạo ra các sản phẩm trong phản ứng viêm và tiêu diệt bởi các đại thực bào. Theo Mudoki và ctv (2006) đại thực bào sẽ thực bào những mảnh vụn tế bào, các tế bào chết, các bạch cầu trung tính bị thoái hóa. Lớp trong cùng tại trung tâm ổ viêm là các sản phẩn của quá trình đáp ứng viêm, tiêu diệt tác nhân gây bệnh tạo thành thể mủ, không nhìn rõ tế bào và bắt màu khi nhuộm H&E kém.
Các bạch cầu có nhân lớn bắt màu tím đậm của Hematocylin, tạo thành lớp dày đặc bao quanh ổ viêm. Trong số các bạch cầu này chủ yếu là các lympho bào hình tròn, nhân đặc bắt màu tím của Hematocylin và tế bào chất rất ít. Trong những điều kiện bệnh lý nhất định, số lượng các tế bào lympho tăng lên rất cao, đồng thời các tế bào sản sinh kháng thể cũng tập trung với số lượng lớn (Davinson ctv.1993;1997; Lin ctv.1998). Moore ctv (1998) đã chứng minh được sự tiếp thụ kháng nguyên bởi các tế bào biểu bì và đại thực bào và cũng là bằng chứng về việc xử lý, trình diện kháng nguyên và hoạt hóa tế bào lympho tại chỗ. Khi tiêm vắc xin thấy xất hiện rất nhiều lympho bào và ngày thứ 14 và 21 sau khi tiêm trong khi tiêm nhũ dầu không thấy xuất hiện loại tế bào này.
Khóa luận tốt nghiệp - 2011 51 Đại học Nha Trang
Tiêm vắc xin nhũ dầu
Hiện tượng viêm xuất hiện ngay ngày đầu tiên sau khi tiêm với kích thước ổ viêm nhỏ. Ban đầu chỉ xuất hiện những giọt dầu hình tròn, bầu dục với kích thước khác nhau nằm rải rác, phân tán trong mô cơ. Sau đó xuất hiện các tế bào máu có nhân bắt màu tím của Hematocylin, tế bào chất bắt màu hồng của Eosin nằm xen kẽ trong cơ, tập trung tới xung quanh giọt dầu. Cơ thể cá đã có phản ứng nhanh chóng, ngay sau khi tiêm vắc xin có nhũ dầu. Theo Afonso và ctv (1998), bạch cầu trung tính tập trung khoảng 1 giờ sau khi tiêm tác nhân gây viêm và số lượng sẽ đạt cực đại sau 48 giờ. Tuy nhiên chúng tôi chưa thể khẳng định đây là loại bạch cầu gì do không quan sát được chính xác hình dạng tế bào mà chỉ nhận định có sự có mặt của nhiều tế bào bạch cầu. Vùng quanh giọt dầu, số ít sợi cơ bắt đầu chun lại, tơ cơ rách nát, hoại tử. Ở độ phóng đại lớn có thể thấy rõ các tế bào máu như hồng cầu, bạch cầu tập trung tới vùng có giọt dầu. Diện tích ổ viêm tăng dần vào những ngày thứ 3, 7 và ngày thứ 14 diện tích ổ viêm là lớn nhất. Ổ viêm lan rộng, hoại tử, phá hủy hoàn toàn cấu trúc của hệ cơ và tập trung chủ yếu vào trung tâm ổ viêm. Ngày thứ 3, tập trung dày đặc tế bào máu tại trung tâm ổ viêm, có nhiều đám hồng cầu và bạch cầu có nhân bắt màu đậm của Hematocylin. Cấu trúc cơ vùng ngoại vi ổ viêm lỏng lẻo, thưa dần và có sự xâm nhập của các tế bào máu. Ổ viêm hoại tử nghiêm trọng, không bắt màu hồng của Eosin giống cơ bình thường thay vào đó là màu tím đậm của Hematocylin.
Bắt đầu từ ngày thứ 7 có hiện tượng phân lớp rõ rệt tại ổ viêm cũng như quanh giọt dầu. Trung tâm ổ viêm xuất hiện những khoảng trống lớn do vùng cơ quanh giọt dầu bị hoại tử, mất dần cấu trúc tạo thành. Vùng này bắt màu nhạt hơn so với ngoại vi của ổ viêm. Ngoại vi của ổ viêm có bạch cầu xuất hiện với số lượng khá lớn, dày đặc, bắt màu tím đậm của thuốc nhuộm Hematocylin. Các lớp tế bào hình thành cũng tương tự như khi tiêm vắc xin không kết hợp với nhũ dầu. Tuy nhiên, sự xâm nhập của các tế bào máu và hình thành ổ viêm nhanh hơn so với khi tiêm vắc xin. Ngày thứ 14 sau khi tiêm vắc xin có nhũ dầu có diện tích ổ viêm lớn nhất, trung
Khóa luận tốt nghiệp - 2011 52 Đại học Nha Trang
tâm ổ viêm rỗng lớn không có sự hiện diện của các tế bào, có dạng keo, bắt màu thuốc nhuộm kém. Giai đoạn đầu, hiện tượng tăng sinh chủ yếu thấy ở các tế bào nội mô và bao quanh ổ viêm, các bạch cầu tăng số lượng để chống đỡ kịp thời với nguyên nhân gây viêm. Mặt khác ở trung tâm ổ viêm tình trạng thiếu oxy nghiêm trọng nên hiện tượng tăng sinh không thể tiến hành được.
Tham khảo những nghiên cứu trước đây cho thấy kháng nguyên hòa tan khi sử dụng kết hợp với chất bổ trợ sẽ làm tăng đáp ứng miễn dịch. Theo Avtalion và ctv (1980) phát hiện rằng vắc xin BSA phối hợp với chất bổ trợ hoàn chỉnh CFA gây miễn dịch mạnh mẽ ở cá chép nhưng BSA hòa tan trong nước muối sinh lý lại không gây đáp ứng miễn dịch. Đối với cá Hồi (Rainbow trout) BSA phối hợp với CFA cũng gây đáp ững miễn dịch cao (Hodgins và ctv, 1967). Các tế bào đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch như bạch cầu xuất hiện ngay ngày đầu tiên sau khi tiêm, lympho bào và đại thực bào tập trung với số lượng lớn ngày thứ 7 sau khi tiêm vắc xin nhũ dầu. Cho thấy phản ứng nhanh chóng của cơ thể trước sự xâm nhập của kháng nguyên lạ thể hiện bằng cách huy động lượng lớn các tế bào máu tham gia đáp ứng viêm khi tiêm vắc xin có nhũ dầu. Cơ thể cá rất nhạy với kháng nguyên kết hợp với chất bổ trợ là dầu, gây đáp ứng miễn dịch nhanh và mạnh thể hiện ở mức độ lan phát triển của ổ viêm và sự huy động các tế bào máu.
Khóa luận tốt nghiệp - 2011 53 Đại học Nha Trang
Phần V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
------
5.1. Kết luận
- Phương pháp mô học là phương pháp thích hợp cho nghiên cứu sự phát triển ổ viêm và đi sâu tìm hiểu cơ chế viêm và đáp ứng miễn dịch của cá.
- Quá trình viêm khi tiêm nhũ dầu, vắc xin không có nhũ dầu và vắc xin nhũ dầu vào cơ cá giò theo một quy luật chung nhất định.
Quan sát trên tiêu bản mô nhận thấy những biến đổi mô đầu tiên sau khi tiêm vắc xin như: mô cơ liên kết lỏng lẻo, sợi cơ bị đứt gãy, tơ cơ rách nát, bắt đầu có hiện tượng hoại tử. Xen kẽ những sợi cơ, quanh vùng cơ bị thương tổn xuất hiện các tế bào máu.
Biến đổi ở cấp độ tế bào có thể quan sát thấy tế bào hồng cầu và bạch cầu hạt là những tế bào xuất hiện ở vùng viêm đầu tiên. Sau khi xuất hiện số lượng lớn các bạch cầu là sự xuất hiện của các tế bào đại thực bào. Cuối cùng xuất hiện nhiều lympho bào trong đám những bạch cầu nhưng không phát hiện được ở quá trình viêm chỉ với nhũ dầu.
- Tuy nhiên, cơ chế viêm xuất hiện, tiến triển và kết thúc tại vị trí tiêm vào những thời điểm khác nhau tùy thuộc vào từng loại kháng nguyên được dẫn truyền.
Kháng nguyên là nhũ dầu thì ổ viêm xuất hiện và tồn tại trong khoảng thời gian ngắn. Ngày thứ 3 sau khi tiêm ổ viêm phát triển mạnh nhất và tập trung nhiều các loại tế bào tham gia cơ chế viêm nhất. Sau đó giảm dần, tới ngày thứ 21 sau khi tiêm dường như không còn sự tồn tại của ổ viêm.
Kháng nguyên là vi khuẩn vi khuẩn nhóm Vibrio bất hoạt, không kết hợp với nhũ dầu có hiệu quả gây viêm kém hơn khi kết hợp với nhũ dầu. Xuất hiện từ ngày thứ 7 với kích thước khá nhỏ, không thể quan sát được bằng mắt thường trên tiêu bản và kéo dài tới ngày thứ 21 sau khi tiêm. Diện tích ổ viêm cũng tăng dần và gây
Khóa luận tốt nghiệp - 2011 54 Đại học Nha Trang
hoại tử mạnh mẽ tại vị trí dẫn truyền kháng nguyên. Diện tích ổ viêm tăng dần trong 14 và 21 ngày.
Kháng nguyên là vi khuẩn bất hoạt kết hợp với chất bổ trợ (nhũ dầu) cho hiệu quả gây viêm nhanh và mạnh nhất. Xuất hiện ngay từ ngày đầu tiên sau đó tăng dần, ổ viêm lớn nhất vào ngày thứ 14 sau khi tiêm và giảm vào ngày thứ 21 sau khi tiêm.
- Vi khuẩn bất hoạt kết hợp với chất bổ trợ gây ra đáp ứng viêm là lớn nhất, huy động được lượng lớn các loại tế bào máu tham gia. Trong đó có những tế bào như bạch cầu, các đại thực bào và tế bào lympho dóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch.
5.2. Kiến nghị
Trong quá trình nghiên cứu do số lượng và kích thước mẫu nhỏ do đó chúng tôi mới chỉ mới quan sát được sự xuất hiện và phát triển của ổ viêm ở 1, 3, 7, 14 và 21 ngày sau khi tiêm. Để nghiên cứu được hết các giai đoạn phát triển tới khi kết thúc đáp ứng viêm cần có những nghiên sâu hơn.
Trên các lát cắt mô học, quan sát thấy sự xuất hiện của các loại tế bào tham gia vào phản ứng viêm. Tuy nhiên đây chỉ là những quan sát ban đầu dựa vào hình thái tế bào. Cần có những nghiên cứu hiện đại hơn như kháng thể huỳnh quang để có kết quả chính xác hơn và có thể quan sát được sự xuất hiện của kháng thể và các loại tế bào này trong cơ sau khi tiêm vắc xin.
Khóa luận tốt nghiệp - 2011 55 Đại học Nha Trang
Tài liệu tham khảo
Tài liệu tiếng Việt:
1. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004,
Bệnh học thủy sản, Nhà xuất bản nông nghiệp Tp.Hồ Chí Minh, 2004, trang 130,131.
2. Phạm Văn Thư, Sử dụng vắc xin trong nuôi trồng thủy sản, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1.
3. PGS.TS. Đỗ Thị Hòa, Ths.Trần Vỹ Hích, Ks.Nguyễn Thị Thùy Giang, Ths.Phan Văn Út, Ks.Nguyễn Thị Nguyệt Huê,2008, Các loại bệnh thường gặp trên cá biển nuôi ở Khánh Hòa, Tạp chí khoa học – Công nghệ thủy sản – Số 02/2008, trang 17.
4. TS. Bùi Quang Tề, 2006 Bệnh học thủy sản, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1.
5. Nguyễn Thị Hồng, 2007, Nghiên cứu ảnh hưởng của việc kết hợp Atemia bung dù với thức ăn công nghiệp trong ương nuôi ấu trùng cá Giò (Rachycentron cândum, Linnaeus, 1766), Luận văn thạc sỹ nông nghiệp, Tr: 19-21.
6. Huy, N.Q. 2002. Tình hình sinh sản và nuôi cá Giò (Rachycentron
canadum). Tạp chí Thuỷ sản số 7-2002.
7. Phan thị Vân, 2006. Nghiên cứu tác nhân gây bệnh phổ biến đối với cá Mú, cá Giò nuôi và đề xuất các giải pháp phòng trị bệnh, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1.
Khóa luận tốt nghiệp - 2011 56 Đại học Nha Trang
Tài liệu tiếng Anh:
9. John W. Machen, 2008, Vibrio spp disinfection and immunization of Cobia ( Rachycentron canadum) for the prevention of disease in aquaculture facilities, Master of science in Biomedical Veterinary science.
10. Liu P-C., Lin J-Y and Lee K-K. (2003). Virulence of Photobacterium damselae subsp. piscicida in cultured cobia Rachycentron canadum. J. Basic Microbiol.43 (2003) 6, 499-507.
11.Lopez C., Rajan P.R., Lin J.H-Y., Kuo T.Y & Yang H-L. (2002). Disease outbreak in seafarmed Cobia (Rachycentron canadum) associated with
Vibrio Spp., Photobacterium damselae ssp.piscicida, monogenean and myxosporean parasites. Fish Pathol, 22 (3) 2002.
12. Mutoloki S, Alexandersen S, Evensen Ø. Sequential study of antigenpersistence and concomitant inflammatory reactions relative to sideeffects and growth of Atlantic salmon (Salmo salar L.)
followingintraperitoneal injection with oil-adjuvanted vaccines. Fish Shellfish Immunol 2004;16; 45-633.
13. OIE, 2009. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2009. Chapter 2.3.7.
14. Poppe TT, Breck O. Pathology of Atlantic salmon Salmo salarintraperitoneally immunized with oil-adjuvanted vaccine. A case report. Dis Aquat Org 1997;p29;26-219.
15.Robert R.J.,2001; Fish pathology, 3rd edn. W.B.Saunders, Philadelphia,PA chapter 4.
16.Stephen Mutoloki, 2006, A comparative immunopathological study of injection site reactions in salmonids following intraperitoneal injection with
Khóa luận tốt nghiệp - 2011 57 Đại học Nha Trang
17.Stephen Mutoloki, 2010. High gene expression of inflammatory markers
and IL-17A correlates with severity of injection site reactions of Atlantic salmon vaccinated with oil-adjuvanted vaccines.
18. Mutoloki S, Brudeseth B, Reite OB, Evensen Ø. The contribution of Aeromonas
salmonicida extracellular products to the induction of inflammation in Atlantic salmon (Salmo salar L.) following vaccination with oil-based vaccines. Fish Shellfish Immunol 2006;20(1):1–11
Tài liệu Internet:
19.http://vi.wikipedia.org/wiki/Vi%C3%AAm
20.http://yhoccotruyen.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=4015:vi em&catid=47:y-hoc-co-so-sinh-ly-benh&Itemid=167
21.http://education.vetmed.vt.edu/Curriculum/VM8054/Labs/Lab5/Lab5.htm