Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Nghiên cứu tính chịu hạn của thực vật về mặt sinh lý, sinh hóa và cấu trúc tế bào ngƣời ta nhận thấy một loạt những biến đổi sâu sắc ở tất cả các mức độ khác nhau, trong các giai đoạn phát triển khác nhau. Các kết quả nghiên cứu đã khẳng định đặc tính chịu hạn do nhiều gen chi phối và đƣợc biểu hiện ở những giai đoạn phát triển khác nhau của cây. Một số gen liên quan đến tính chịu hạn của cây lúa đã đƣợc nghiên cứu và phân lập, nhƣ gen dehydrin, cystatin, LTP.
LTP là tên thƣờng gọi của một nhóm protein có khả năng vận chuyển lipid, có liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật. LTP có khả năng tạo phức với một số acid béo và xúc tác cho quá trình vận chuyển lipid qua màng tế bào, giúp hạn chế sự mất nƣớc. LTP đƣợc gắn tại một vị trí cố định trên màng sinh chất của tế bào, nó có đặc điểm nhƣ một receptor vận chuyển acid béo qua màng tế bào. Phức hợp LTP - linoleic acid đã đƣợc chiết ra từ màng sinh chất của cây thuốc lá trong điều kiện gây hạn nhân tạo.
Bên cạnh đó, LTP còn liên quan đến quá trình hình thành tầng cutin của tế bào thực vật, làm tăng khả năng chống chịu và hạn chế tác hại của stress muối và stress hạn [44]. Nghiên cứu trên cây đậu xanh, Liu và cs (2003) nhận thấy rằng hàm lƣợng mRNA của LTP sẽ tăng cao trong điều kiện stress muối, stress hạn hay khi hàm lƣợng ABA ngoại bào tăng cao [31].
LTP còn tham gia vào hệ thống miễn dịch của thực vật. Nghiên cứu trên cây lúa, Blilou và cs (2005) nhận thấy tốc độ tổng hợp LTP tăng nhanh khi có sự xâm nhập của loài nấm Glomus mosseae vào biểu bì rễ và giảm khi nấm tấn công vào khoảng gian bào [23]. Carvalho và cs (2006) khi nghiên cứu trên cây đậu đũa (Vigna unguiculata (L.) Walp) nhận thấy LTP là peptide kháng khuẩn tham gia vào việc bảo vệ cây chống lại các mầm bệnh [25].
LTP đƣợc chia thành hai dạng khác nhau về khối lƣợng phân tử. Dạng thứ nhất có khối lƣợng phân tử khoảng 9 kDa (LTP1) và dạng thứ hai có khối
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
lƣợng phân tử khoảng 7 kDa (LTP2). Cả LTP1 và LTP2 đều có một vùng bảo thủ gồm 8 amino acid loại cystatin và 4 amino acid loại prolin [29].
LTP thuộc họ gen pathogenesis - relate, có khả năng tổng hợp protein thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid tới màng. LTP còn hỗ trợ việc tạo ra lớp sáp hoặc lớp biểu bì giúp thực vật bảo vệ, phản ứng và đáp lại những thay đổi của môi trƣờng (Kader, 1996) [29].
Những nghiên cứu gần đây cho thấy sự mở rộng in vitro các hợp tử cenllulose xyloglucan của thành tế bào thực vật có thể đƣợc gây ra bởi các LTP, mặc dù chƣa có bằng chứng in vitro song khám phá này chắc chắn sẽ đem lại những thắc mắc về cơ chế mở rộng thành tế bào thực vật (Nieuwland và cs, 2005) [36]. Những phân tử protein do gen LTP tổng hợp thƣờng có đặc điểm chung là: điểm đẳng điện cao, khối lƣợng phân tử khoảng 9,12 kDa và sự có mặt của 8 phân tử cysteine làm nhiệm vụ tạo ra 4 cầu nối disulfide (Torres Schumann và cs, 1992) [39]. Khi gặp các điều kiện cực đoan của môi trƣờng, các nhân tố nhƣ hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đƣờng truyền tín hiệu… sẽ điều khiển gen LTP hoạt động và tổng hợp nên các sản phẩm protein tƣơng ứng và tăng cƣờng vận chuyển phospholipid tới màng, tăng tính bền vững của thành tế bào và khả năng giữ nƣớc của màng nhằm giúp cho cây chống stress hạn.
Ngoài ra vai trò của LTP là tham gia vào cấu tạo cutin, phản ứng bảo vệ chống bệnh của cây và đáp ứng sự thích nghi biến đổi của môi trƣờng [24], [27], [28].
LTP là một nhóm protein có số lƣợng lớn trong thực vật bậc cao (chiếm tới 4% tổng số lipid hòa tan). Ở thực vật, chúng không chỉ tham gia vào sự hình thành lớp cutin - có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ mô thực vật chống lại tác nhân gây bệnh ở thực vật và quá trình thích nghi của cây với các điều kiện khác nhau của môi trƣờng sống (Kader, 1996) [29]. Gen Mã hóa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
LTP lần đầu tiên đƣợc Chang và cs đã phân lập từ mRNA và đọc trình tự cDNA ở cây ngô năm 1988 [38], sau đó là nhiều trình tự trên các đối tƣợng khác nhau đƣợc công bố nhƣ ở cà chua (Torres Schumann và cs, 1992) [39],
Arabidopsis thaniana L. [21], thuốc lá (Masuta và cs, 1992) [32], cây đậu xanh (Nguyễn Vũ Thanh Thanh và cs, 2009) [18]; Chu Hoàng Mậu và cs, 2009 [14], Oryza sativa L. [41], Valencia orange [43].
Hiện nay, gen LTP ở thực vật đƣợc biết có 4 nhóm lớn:
- Nhóm I: Bao gồm các CsLTP chứa các bộ mã hoá protein đã đƣợc cô lập và biểu hiện ở trong quả.
- Nhóm II: Bao gồm những gen LTP tổng hợp ra protein đƣợc biểu hiện trong hạt.
- Nhóm III: Bao gồm các gen LTPs tổng hợp ra protein đƣợc biểu hiện trong mô lá. Chúng đƣợc tạo ra khi có những ảnh hƣởng của môi trƣờng nhƣ tình trạng khô hạn và các tác nhân có thể gây bệnh.
- Nhóm IV: Bao gồm các gen LTP tổng hợp nên các chuỗi polypeptide đƣợc cô lập và biểu hiện trong hoa [29], [34].
Đối với cây lúa cạn, Nguyễn Thị Ngọc Lan và đtg (2009) đã so sánh, phân lập đƣợc gen mã hóa lipid tranfer protein của các giống lúa cạn địa phƣơng khác nhau về khả năng chịu mất nƣớc [6]. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy gen LTP phân lập từ giống lúa cạn Khẩu Lẩy Khao có kích thƣớc 420 bp, còn ở giống Giằng Bau là 417 bp và cả hai gen LTPs đều không mang đoạn intron. So với trình tự gen LTP của giống lúa Yukihikari thì trình tự gen LTP của hai giống lúa này có độ tƣơng đồng từ 98,1% đến 100%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP