3.2.2.1. Kết quả nhân gen và tách dòng gen LTP
Kết quả nhân gen LTP bằng kỹ thuật PCR
Sử dụng DNA hệ gen làm khuôn để nhân gen LTP với cặp mồi đƣợc thiết kế dựa trên trình tự cDNA phân lập từ giống lúa Yukihikari (Nhật Bản) đƣợc công bố bởi Masuta và cs (2003), có mã số ở GenBank là AY466108 [35]. Trên cơ sở xác định đƣợc nồng độ khuôn tối ƣu cho phản ứng PCR, chúng tôi đã tiến hành nhân gen LTP của 2 giống lúa cạn có khả năng chịu hạn tốt nhất (NA3) và kém nhất (NA6).
Hình 3.7. Kết quả điện di đoạn gen LTP đƣợc nhân lên bằng kỹ thuật PCR
M. Thang DNA chuẩn 1kb; 1. NA3; 2. NA6
Kết quả nhân gen cho thấy ở mẫu nghiên cứu xuất hiện phân đoạn DNA đặc hiệu có kích thƣớc ƣớc tính khoảng 0,4kb. Kích thƣớc của sản phẩm PCR nhận đƣợc chính bằng kích thƣớc phân tử cDNA của gen LTP của giống lúa Yukihikari - Nhật Bản.
Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR
Vì sản phẩm PCR ngoài đoạn gen mong muốn còn có sản phẩm phụ, các nucleotide dƣ thừa sau phản ứng, mồi, enzyme… Vì vậy, để quá trình biến nạp đạt hiệu quả cao nhất, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch (thôi gel) sản
0,4kb 0,5kb
0,25kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
phẩm PCR theo bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas để thu nhận đoạn gen mong muốn trƣớc khi biến nạp. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR đƣợc thể hiện ở hình 3.8.
Hình 3.8: Kết quả điện di DNA thu đƣợc từ kỹ thuật thôi gel
M. Thang DNA chuẩn 1kb; 1. NA3; 2. NA6
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến và chọn dòng plasmid tái tổ hợp mang gen LTP
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch đƣợc gắn vào vector tách dòng pTZ57R/T nhờ enzyme nối T4 ligase.
Phản ứng ghép nối dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa hai đầu nucleotide A thò ra ở sản phẩm PCR với Taq - polymerase và hai đầu nucleotide T trên vector tách dòng pTZ57R/T . Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220
C trong 1h cho phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli
DH5α và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có bổ sung kháng sinh ampicillin (100mg/l), X-gal (40mg/l) và IPTG (100µM). Ủ đĩa ở 370
C trong 16 giờ. Trên môi trƣờng chọn lọc này, các khuẩn lạc có chứa vector tái tổ hợp sẽ có màu trắng và các khuẩn lạc không có chứa vector tái tổ hợp sẽ có màu xanh. Tiến hành chọn 3 khuẩn lạc có màu trắng chuyển sang nuôi trong môi trƣờng LB lỏng (có bổ sung ampicillin 100mg/l), tốc độ lắc 200 vòng/phút ở 370
C qua đêm.
0,5kb 0,4kb
0,25kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Các khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp đƣợc chọn bằng phƣơng pháp colony-PCR để phục vụ cho bƣớc tiếp theo. Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng PCR với cặp mồi pUC 18 để xác định khuẩn lạc có mang gen mong muốn. Sản phẩm clony-PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím. Kết quả điện di sản phẩm clony- PCR đƣợc thể hiện ở hình 3.8.
Vì pUC là mồi thiết kế chung cho các vector tách dòng nên khi kiểm tra sản phẩm colony-PCR vừa dòng hoá thì kích thƣớc của sản phẩm sẽ cao hơn đoạn gen mã hóa LTP. Kết quả kiểm tra cho thấy kích thƣớc của sản phẩm PCR với mồi pUC vào khoảng 0,52kb (hình 3.8).
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR
M. Thang DNA chuẩn 1kb; 1. NA3; 2. NA6
Từ kết quả điện di ở hình 3.9 cho thấy, sản phẩm colony-PCR từ những khuẩn lạc màu trắng đều cho kết quả dƣơng tính, tất cả hai mẫu đều cho một băng duy nhất đúng kích thƣớc. Nhƣ vậy, kết quả bƣớc đầu đã chọn đƣợc dòng plasmid mang gen LTP tái tổ hợp. Các dòng mang plasmid có gen LTP đƣợc nhân lên để tách plasmid.
0,52kb 0,5kb
0,75kb
1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tách DNA plasmid tái tổ hợp
Sau khi kết quả biến nạp và chọn dòng đã đƣợc thực hiện tốt, phản ứng PCR đã đạt mức tối ƣu, chúng tôi tiếp tục tiến hành tách plasmid theo bộ Kit AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Sản phẩm tách plasmid đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím. Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid mang gen LTP của hai giống lúa cạn nghiên cứu đƣợc thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.10. Kết quả điện di plasmid tinh sạch chứa đoạn gen LTP
M. Thang DNA chuẩn 1kb; 1. NA3; 2. NA6
Để khẳng định lại các plasmid cần tìm có gắn đoạn gen sản phẩm PCR hay không, chúng tôi đã chọn DNA plasmid đã tinh sạch của mẫu thí nghiệm để tiến hành cắt bằng enzym giới hạn EcoRI ở 370
C trong 2 giờ.Vị trí của enzym này trong vector là nằm ở hai đầu đoạn gắn. Theo lý thuyết, nếu phản ứng cắt enzym xảy ra thành công thì sẽ thu đƣợc 2 phân đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 2886bp là của vector pTZ57R/T và phần còn lại là của gen LTP khoảng 417 - 420bp
Kết quả phân tích bằng enzym giới hạn cho thấy plasmid pTZ57R/T tái tổ hợp mang đoạn DNA đã xen đƣợc vào, với kích thƣớc phân tử tƣơng đƣơng với sản phẩm PCR (hình 3.11).
M 1 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.11 cho thấy, sau khi phản ứng cắt bằng enzym giới hạn EcoRI
xảy ra và điện di trên gel agarose 1%, cả 2 mẫu nghiên cứu đều có 2 băng, băng trên có kích thƣớc khoảng 2,9kb tƣơng ứng với kích thƣớc của vector và băng dƣới có kích thƣớc khoảng 0,4kb tƣơng đƣơng với kích thƣớc của đoạn gen LTP. Nhƣ vậy, đoạn gen LTP đã đƣợc tách dòng và đủ điều kiện để tiến hành đọc trình tự nucleotide.
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzym EcoRI
M. Thang DNA chuẩn 1kb; 1. NA3; 2. NA6
3.2.2.2. Kết quả xác định trình tự nucleotid của đoạn gen LTP
Tiến hành xác định trình tự nucleotide của gen LTP ở 2 mẫu nghiên cứu NA3 và NA6 trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analizer. Kết quả xác định trình tự đƣợc xử lý bằng phần mềm BioEdit. Kết quả phân tích trình tự gen LTP của 2 giống NA3 và NA6, đoạn gen LTP tách dòng đƣợc có kích thƣớc đúng với dự tính trong đó NA3 có chiều dài là 417 nucleotide, NA6 là 420 nucleotide (hình 3.12).
So sánh trình tự nucleotide của gen LTP của giống NA3 với NA6 và với các giống đã công bố
Dựa vào kết quả giải trình tự gen LTP của NA3 và NA6 chúng tôi so sánh với trình tự của giống Yukihikari đã đƣợc công bố trên Genbank với mã số AY466108, kết quả thống kê các điểm thay đổi nucleotide của gen LTP đƣợc thể hiện trong bảng 3.6. 1 M 2 2,9kb 0,4kb 3,0kb 0,5kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.6. Thống kê các nucleootit sai khác giữa giống NA3 với NA6 và Yukihikari-Nhật Bản
STT Vị trí Yukihikari NA3 NA6
1 31 C C G 2 37 C C G 3 39 - - C 4 40 - - G 5 41 - - T 6 45 C C T 7 48 C C G 8 52 G G A 9 55 C C G 10 58 T T A 11 61 A A T 12 263 G G T
Từ kết quả thống kê chúng tôi thấy trình tự gen LTP ở hai giống NA3 và Yukihikari đều gồm 417 nucleotide, còn giống NA6 nhiều hơn 3bp là CGT ở vị trí 39, 40, 41 gồm 420 nucleotide. Mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide của giống lúa cạn chịu hạn tốt NA3 với Yukihikari là 100%. Giống lúa cạn chịu hạn kém NA6 đạt 98,1% so với hai giống NA3 và Yukihikari, trong đó có sai khác 12 nucleotide lần lƣợt ở các vị trí 31, 37, 39, 40, 41, 45, 48, 52, 55, 58, 61, 263. Trình tự gen LTP của hai giống lúa cạn NA3 và NA6 là những trình tự đƣợc phân lập từ DNA hệ gen so với trình tự gen LTP hoàn chỉnh đƣợc phân lập từ mARN của giống Yukihikari cho thấy trình tự gen LTP mà chúng tôi phân lập và đọc trình tự đều không mang đoạn intron.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50
Yukihikari ATGGCCGGCA AGAAGGTGCA GGTTTGTGCG CTGTTCCT-- -TGCCCTCAA
NA3 ATGGCCGGCA AGAAGGTGCA GGTTTGTGCG CTGTTCCT-- -TGCCCTCAA
NA6 ATGGCCGGCA AGAAGGTGCA GGTTTGTGCG GTGTTCGTCG TTGCTCTGAA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100
Yukihikari TGTGCTCTTC ACCATGCAGA TGGGTGCAGT AGTGCAGGCA TGCGAGCCCT
NA3 TGTGCTCTTC ACCATGCAGA TGGGTGCAGT AGTGCAGGCA TGCGAGCCCT
NA6 TATGGTCATC TCCATGCAGA TGGGTGCAGT AGTGCAGGCA TGCGAGCCCT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150
Yukihikari ACTGCCCCAC ACCGACGCCG CCGGTGACGC CGCCTCCGTC GCCGCCGTCG
NA3 ACTGCCCCAC ACCGACGCCG CCGGTGACGC CGCCTCCGTC GCCGCCGTCG
NA6 ACTGCCCCAC ACCGACGCCG CCGGTGACGC CGCCTCCGTC GCCGCCGTCG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 160 170 180 190 200
Yukihikari GGTGGAGGGA ATAAGTGCCC GATCGACGCG CTGAAGCTGA GCGTGTGCGC
NA3 GGTGGAGGGA ATAAGTGCCC GATCGACGCG CTGAAGCTGA GCGTGTGCGC
NA6 GGTGGAGGGA ATAAGTGCCC GATCGACGCG CTGAAGCTGA GCGTGTGCGC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250
Yukihikari CAACGTGCTC AACCTGCTGA AGCTGAAGAT CGGCGTGCCG GAGAGCGAGC
NA3 CAACGTGCTC AACCTGCTGA AGCTGAAGAT CGGCGTGCCG GAGAGCGAGC
NA6 CAACGTGCTC AACCTGCTGA AGCTGAAGAT CGGCGTGCCG GAGAGCGAGC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 260 270 280 290 300
Yukihikari AGTGCTGCCC GTGGCTGGGT GGCCTCGTCG ACCTCGACGC CGCCGTCTGC
NA3 AGTGCTGCCC GTGGCTGGGT GGCCTCGTCG ACCTCGACGC CGCCGTCTGC
NA6 AGTGCTGCCC GTTGCTGGGT GGCCTCGTCG ACCTCGACGC CGCCGTCTGC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 310 320 330 340 350
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
NA3 CTCTGCACCG CCATCAAGGC CAACATCCTC GGCATCAATC TCAACATCCC
NA6 CTCTGCACCG CCATCAAGGC CAACATCCTC GGCATCAATC TCAACATCCC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 360 370 380 390 400
Yukihikari CGTCGATCTC TCTCTCCTTC TCAACTACTG CCACAAGACC TGCCCCTCCG
NA3 CGTCGATCTC TCTCTCCTTC TCAACTACTG CCACAAGACC TGCCCCTCCG
NA6 CGTCGATCTC TCTCTCCTTC TCAACTACTG CCACAAGACC TGCCCCTCCG ....|....| ....|....|
410 420
Yukihikari ACTTCACCTG CCCTCTCTAA
NA3 ACTTCACCTG CCCTCTCTAA
NA6 ACTTCACCTG CCCTCTCTAA
Hình 3.12. Trình tự gen LTP của giống NA3, NA6 và giống Yukihikari - Nhật Bản
So sánh trình tự amino acid của protein suy diễn ở giống NA3 với NA6 và với giống Yukihikari
Sử dụng trình tự aminoacid đoạn gen LTP đã tách dòng đƣợc của 2 giống NA3 có tổng số nucleotide là 417 và NA6 có 420 nucleotide, cả hai cùng không mang đoạn intron. Sử dụng phần mềm BioEdit dịch mã giả thuyết đoạn gen này sang protein, kết quả thu đƣợc 138 aminoacid ở giống NA3 và 139 aminoacid ở giống NA6 (hình 3.13).
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50
Yukihikari MAGKKVQVCA LF-LALNVLF TMQMGAVVQA CEPYCPTPTP PVTPPPSPPS
NA3 MAGKKVQVCA LF-LALNVLF TMQMGAVVQA CEPYCPTPTP PVTPPPSPPS
NA6 MAGKKVQVCA VFVVALNMVI SMQMGAVVQA CEPYCPTPTP PVTPPPSPPS
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100
Yukihikari GGGNKCPIDA LKLSVCANVL NLLKLKIGVP ESEQCCPLLG GLVDLDAAVC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
NA6 GGGNKCPIDA LKLSVCANVL NLLKLKIGVP ESEQCCPLLG GLVDLDAAVC
....|....| ....|....| ....|....| ....|.... 110 120 130
Yukihikari LCTAIKANIL GINLNIPVDL SLLLNYCHKT CPSDFTCPL
NA3 LCTAIKANIL GINLNIPVDL SLLLNYCHKT CPSDFTCPL
NA6 LCTAIKANIL GINLNIPVDL SLLLNYCHKT CPSDFTCPL
Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống lúa cạn NA3, NA6 và Yukihikari - Nhật Bản
Khi so sánh, tổng hợp các vị trí amino acid sai khác về trình tự của giống NA3 với NA6 và Yukihikari - Nhật Bản, kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.7
Bảng 3.7. Vị trí sai khác về trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống lúa cạn NA3, NA6 và Yukihikari - Nhật Bản
STT Vị trí Yukihikari NA3 NA6
1 11 L L V 2 13 - - V 3 14 L L V 4 18 V V M 5 19 L L V 6 20 F F I 7 21 T T S
Kết quả so sánh trình tự amino acid giữ a giố ng NA3 và giố ng Yukihikari cho thấ y không có vị trí sai khác nào, độ
tư ơ ng đồ ng là 100%. Khi so sánh giố ng NA3, Yukihikari vớ i NA6 cho thấ y có 7 điể m sai khác, trong 7 điể m thay đổ i vị
trí amino acid thì có ba vị trí chuyể n từ Val ở giố ng NA6 thành Leu ở giố ng NA3 và Yukihikari ở các vị trí 11, 14 và 19; giố ng NA6 có nhiề u hơ n giố ng NA3 và Yukihikari 1 amino
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
acid ở vị trí 13 là Val; còn 3 vị trí còn lạ i củ a giố ng NA6 là sự chuyể n đổ i Met ở vị trí 18 thành Val, ở vị
trí 20 Ile Phe và Ser Thr ở vị trí 21 so vớ i giố ng NA3 và Yukihikari. Có thể sự sai khác trình tự nucleotide dẫ n đế n thay đổ i mộ t số amino acid dẫ n đế n thúc đẩ y quá trình sinh tổ ng hợ p protein, làm tăng quá trình vận chuyển phospholipid tới màng, hỗ trợ việc tạo ra lớp sáp hoặc lớp biểu bì giúp bảo vệ thực vật. Đây có thể là một trong những nguyên nhân tạo ra giống lúa chịu hạn tốt. Tuy nhiên để khẳng định điều này cần nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và sự biểu hiện của protein trên.
Nhận xét kết quả tách dòng gen LTP ở giống NA3 và NA6
(1) Đã tách dòng thành công và đọc trình tự gen LTP của hai giống lúa cạn NA3 và NA6. Trình tự gen LTP của NA3 dài 417 nucleotide và của NA6 nhiều hơn 3bp là CGT ở vị trí 39, 40, 41 gồm 420 nucleotide. So sánh với trình tự gen của giống lúa chịu hạn Yukihikari - Nhật Bản trên Genbank cho thấy, đoạn gen LTP của giống NA3 có độ tƣơng đồng là 100%; còn giống NA6 có 12 vị trí thay đổi cụ thể ở các điểm: 31, 37, 39, 40, 41, 45, 48, 52, 55, 58, 61, 263, mức độ tƣơng đồng đạt 98,1%.
(2) Trình tự gen LTP của hai giống lúa cạn NA3 và NA6 là những trình tự đƣợc phân lập từ DNA hệ gen so với trình tự gen LTP hoàn chỉnh đƣợc phân lập từ mARN của giống Yukihikari cho thấy hai trình tự gen LTP mà chúng tôi phân lập đƣợc và đọc trình tự đều không mang đoạn intron. Đoạn mã hóa của gen LTP ở giống NA3 có tổng số nucleotide là 417, tƣơng ứng với 138 amino acid, giống NA6 có 420 nucleotide, tƣơng ứng mã hóa cho 139 amino acid. So sánh trình tự amino acid giữa giống NA3, NA6 và giống Yukihikari cho thấy NA6 có 7 điểm thay đổi vị trí amino acid so với NA3 và Yukihikari (11, 13, 14, 18, 19, 20, 21).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sự sai khác về trình tự nucleotide và trình tự amino acid ở trên là cơ sở để chúng tôi có những nghiên cứu tiếp theo trên nhiều giống lúa cạn hơn nữa và so sánh giữa hai nhóm chịu hạn tốt và kém nhằm tìm kiếm tính quy luật của sự thay đổi vị trí các nucleotide và amino acid liên quan đến tính chịu hạn của các giống lúa cạn. Đây là tiền đề tạo cơ sở cho việc nghiên cứu chọn tạo các giống lúa có khả năng chịu hạn tốt, phục vụ cho phát triển cây lúa cạn.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. KẾT LUẬN
1.1.Các giống lúa cạn nghiên cứu có phản ứng khác nhau đối với hạn, biểu hiện ở các chỉ tiêu: tỷ lệ thiệt hại, khả năng giữ nƣớc, chiều dài rễ, chỉ số chịu hạn tƣơng đối và hàm lƣợng prolin ở giai đoạn cây mạ. Hai giống NA1, NA3 có khả năng chịu hạn cao nhất, hai giống NA6 và LC có khả năng chịu hạn thấp nhất.
1.2. Các giống lúa cạn tham gia thí nghiệm về khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây mạ có thể xếp thành 4 nhóm khác nhau về mức độ chịu hạn: Nhóm chịu hạn tốt nhất có hai giống: NA3 và NA1; tiếp đến là hai giống NA2 và CB1; xếp thứ Ba là ba giống NA5, CB2 và NA4; nhóm chịu hạn kém nhất gồm hai giống LC và NA6.
1.3.Đã khuếch đại, tách dòng thành công và xác định trình tự gen LTP của hai giống lúa cạn địa phƣơng Tƣơng Dƣơng - Nghệ An (NA3 và NA6). Gen LTP của giống NA3 có 417 nucleotide mã hóa cho 138 amino acid, gen LTP của giống NA6 có kích thƣớc 420 nucleotide mã hóa cho 139 amino acid. Gen LTP của hai giống lúa cạn NA3 và NA6