2.3.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ lá lúa
Kỹ thuật thu và bảo quản lá:
Hạt lúa đƣợc rửa sạch rồi ngâm vào nƣớc ấm (nƣớc 3 sôi 2 lạnh) trong 24 giờ. Gieo các mầm lúa vào các bát, mỗi bát gieo khoảng 30 hạt. Hàng ngày tƣới nƣớc đủ ẩm. Sau 2 tuần, cắt thu lấy lá dùng ngay hoặc bảo quản ở tủ lạnh sâu - 800C.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Phƣơng pháp tách DNA tổng số theo Gawel và cs, 1991 có cải tiến nhƣ sau:
- Lấy 200mg lá non đã để lạnh ở - 800
C nghiền nhanh trong cối chày xứ (cối chày xứ đã đƣợc vô trùng và để ở - 800
C) thành bột mịn.
- Bổ sung 0,8 ml đệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8, Sobitol 2M, NaH2PO4 0,4 %, H2O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịch nổi. Bƣớc này làm 2 lần.
- Thêm 700 μl đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4%, H2O), trộn nhẹ. Ủ 650
C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
- Thêm 600 μl chloroform : isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút. - Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Hút 500 μl dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa.
- Thêm 500 μl isoprropanol, trộn nhẹ đặt lên đá chờ có tủa trắng. - Li tâm 13000 vòng /phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. - Bổ sung 300 μl cồn 70% búng nhẹ.
- Li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn (làm 2 lần). - Làm khô DNA.
- Hoà tan DNA trong 100 μl H2O khử ion.
Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA
Kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng 2 phƣơng pháp:
Điện di trên gel agarose
Chuẩn bị gel agarose 1%, dung dịch đệm dùng cho điện di là TAE 1X. Tra mẫu và chỉ thị phân tử (Marker). Chạy điện di ở 100V trong 30 phút. Nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide (2g/ml; 15 l/bản gel) trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
10 phút. Rửa gel bằng nƣớc cất, sau đó soi qua tia cực tím và chụp ảnh bằng máy Gel Logic 1500 – Kodak –USA.
Phương pháp quang phổ hấp thụ
- Kiểm tra hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 260nm và 280nm.
- Cho 995µl nƣớc cất và 5µl DNA mẫu vào cuvet (hệ số pha loãng 200 lần), lắc đều đặt vào máy đo.
Hàm lƣợng và độ tinh sạch DNA đƣợc tính theo công thức: Hàm lƣợng DNA (ng/μl) = 50 x HSPL x OD260 Độ sạch của DNA = OD260 / OD280
Trong đó: HSPL: hệ số pha loãng
OD260: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 260nm 50: hằng số
OD280: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 280nm
Nếu tỷ lệ OD260/OD280 = 1,8 - 2,0 thì mẫu DNA đƣợc coi là đủ tiêu chuẩn về độ sạch.
2.3.2.1. Tách dòng và xác định trình tự gen LTP
Nhân gen LTP bằng PCR từ DNA hệ gen cây lúa
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi LTPrF/ LTPrR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự cDNA phân lập từ giống lúa Yukihikari (Nhật Bản) đƣợc công bố bởi Masuta và cs (2003) ở GenBank với mã số AY466108 [35], cặp mồi đƣợc tổng hợp tại hãng Invitrogen, trình tự cặp mồi là:
Bảng 2.3. Mồi nhân gen LTP ở lúa
Mồi Trình tự gắn mồi Nhiệt độ gắn mồi
LTPrF 5' - ATGGCCGGCAAGAAGGTGC - 3' 560C
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thành phần phản ứng của phản ứng PCR nhân đoạn gen LTP ở lúa đƣợc trình bày ở bảng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen LTP Thành phần Thể tích (µl) PCR master mix 25 DNA Khuôn (~10 - 50 ng) 2 LTP 1R (10 pmol/µl) 1 LTP1F (10 pmol/µl) 1 DMSO 2,5 Nƣớc khử ion 18,5 Tổng 50
Chu kỳ nhiệt: 940C: 3 phút; lặp lại 30 chu kỳ (940
C- 1 phút, 560C- 1 phút, 720C- 1 phút 30 giây); 720C- 10 phút; 40C - ∞. Sau chu kỳ cuối cùng, chuyển về nhiệt độ 4o
C bảo quản trƣớc khi tinh sạch, bảo quản ở -20o C. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ kít của Hãng Bioneer (AccuPrep PCR Purification Kít) theo qui trình nhƣ sau:
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm - Bổ sung đệm hòa tan (GB - Gel binding buffer) theo tỉ lệ: Vmẫu : VGB:
VIzopropanol = 1 : 3 : 1 (1µl tƣơng ứng với 1mg mẫu). Ủ ở 600
trong 10 phút, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột Qiaquick spin colum, ly tâm 13000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Bổ sung 500 µl dung dịch GB, để 2 phút ở nhiệt độ phòng cho dung dịch GB tiếp xúc hoàn toàn với sản phẩm PCR sau đó ly tâm 13000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Rửa màng lọc chứa DNA của PCR bằng cách cho 500 µl dung dịch WB (Washing buffer) lên trên màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
phút, rồi bỏ dịch dƣới. Ly tâm lại lần hai đảm bảo cho màng chứa DNA của PCR thật khô.
- Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, bổ sung 30 µl dung dịch EB (Elution buffer) lên trên màng lọc, để nhiệt độ phòng 2 phút, đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, sau đó bỏ cột. Thu mẫu DNA đã đƣợc tinh sạch. Bảo quản ở -200
C.
Tạo vectơ tái tổ hợp
Sản phẩm phản ứng PCR sẽ đ ƣợc gắn vào vector pTZ57R/T (Hình 2.3) theo phƣơng pháp dòng hóa TA (TA - cloning) của hãng Invitrogen , có enzym topoisomerase làm enzym nối.
Hình 2.3. Cấu trúc của vector pTZ57R/T
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng
Tên hóa chất Thể tích (µl) Nƣớc tinh khiết 12,2 DNA khuôn 4 Vector pTZ57R/T 1 Ligation buffer 10X 2 Enzyme T4 ligase 0,8 Tổng thể tích 20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220
C trong 1h, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli
Vector tái tổ hợp đƣợc đƣa vào tế bào E. coli chủng DH 5αbằng một quá trình gọi là chuyển nạp (transformation). Đó là quá trình tạo cho plasmid đã đƣợc gắn nối, tiếp xúc với tế bào thích ứng nhằm tạo điều kiện cho chúng xuyên qua màng vào trong nguyên sinh chất. Khi đã đƣợc chuyển nạp, plasmid (có thể tái tổ hợp hoặc không) sẽ cùng nhân lên cùng với tế bào chủ khi nuôi trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp.
Quy trình biến nạp nhƣ sau:
Bổ sung 7µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến Ecoli DH 5α và trộn nhẹ, rồi ủ trong đá lạnh (0 - 4C) trong 30 phút, cho plasmid xuyên qua màng chuyển nạp vào tế bào. Sau đó hỗn hợp đƣợc xử lý sốc nhiệt ở 42C trong 1 phút và ngay lập tức chuyển vào ủ trên đá lạnh trong 5 phút. Bổ
sung 400µl môi trƣờng LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) vào hỗn hợp rồi đem hỗn hợp nuôi lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 370
C để vi khuẩn tái tổ hợp nhân lên trong vài chu kỳ sinh trƣởng và phát triển. Sử dụng que cấy trải, trải 100 - 150µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có chứa kháng sinh ampicillin (100mg/l), X-gal (40mg/l) và IPTG (100µM). Ủ đĩa ở 370
C trong 16 - 20 giờ.
Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp
Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp thực hiện bằng hai phƣơng pháp: chọn lọc theo phản ứng cơ chất (với X -gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn không chuyển nạp thành công vectơ tái tổ hợp, và chọn lọc theo phƣơng pháp kháng sinh ampicillin nhằm loại trừ những vi khuẩn không chuyển nạp đƣợc bất kỳ vector nào và các loại vi khuẩn nhiễm tạp khác.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp đƣợc thực hiện trong buồng cấy vô trùng theo các bƣớc sau:
- Khuẩn lạc màu trắng trên môi trƣờng LB agar đƣợc lựa chọn nuôi cấy trong các ống chứa 5 ml môi trƣờng LB Bactotryptone hoặc casein hydrolysate (10g/l), dịch chiết nấm men (5 g/l) và NaCl (10g/l)], khoảng 10ml nƣớc thịt /ống.
- Bổ sung 5 µl Ampicillin nồng độ là khoảng 50 g/ml để chọn lọc dòng có mang gen kháng kháng sinh.
- Có thể bổ sung thêm X-gal vào môi trƣờng để loại bỏ những ống môi trƣờng có màu xanh (do đoạn gen chƣa gài vào vector) mà khi chọn lọc khuẩn lạc bị lẫn tạp hoặc khi chọn lọc khuẩn lạc có nhân hơi xanh.
- Sau khi cấy khuẩn lạc, ống môi trƣờng đƣợc lắc 200 vòng/phút trong 16 – 20 giờ ở 370
C cho vi khuẩn nhân lên.
Tách DNA plasmid tái tổ hợp
Sƣ̉ dụng bộ hóa chất tách chiết plasmid tái tổ hợp của hãng Bioneer
(AccuPrep™ Plasmid Mini Extraction Kit) để tách chiết plasmid. Tách DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau:
(1) Chuyển dịch nuôi cấy ở trên sang ống Eppendorf 1,5 ml, ly tâm 8000 vòng/phút trong 2 phút để thu tế bào. Sau ly tâm bỏ dịch bên trên, giữ cặn tế bào bên dƣới (dùng pipet hút hết dịch trong giữ lại cặn tế bào).
(2)Thêm 250 µl dung dịch Rasuspension buffer vào để hòa tan cặn, dùng pipet hút nhẹ lên xuống vài lần cho đều.
(3) Thêm 250 µl dung dịch Lysis buffer vào hỗn dịch trên để phá màng tế bào, đậy nắp, nhẹ nhàng trộn bằng cách lắc xuôi ngƣợc toàn bộ vài lần.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
(4) Thêm 350 µl dung dịch Neutralization buffer, trộn nhẹ nhàng, sau đó đem ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ 40
C. (5) Chuyển toàn bộ phần dịch trong bên trên lên trên màng của cột
lọc. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dƣới.
(6) Thêm 500 µl dung dịch Washing A buffer lên trên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng 5 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dƣới.
(7) Thêm 700 µl dung dịch Washing B buffer lên màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dƣới. Ly tâm lại để làm khô cột. (8) Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, thêm 20 µl dung dịch
Utution buffer lên trên màng lọc, để nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột lọc và thu đƣợc dịch chứa DNA plasmid ở dƣới.
Ký hiệu mẫu và bảo quản ở - 200 C.
Kiểm tra vector tái tổ hợp
DNA ngoại lai là sản phẩm của PCR đƣợc tạo dòng vào plasmid pTZ57R/T sẽ đƣợc plasmid nhân lên trong tế bào E. coli và đƣợc tách chiết nhƣ đã trình bày ở trên. Vấn đề là cần thiết kiểm tra, liệu đoạn DNA ngoại lai có phải là từ sản phẩm PCR chúng ta mong muốn hay không? Một trong những phƣơng pháp nhanh nhất là kiểm tra độ dài của đoạn DNA ngoại lai xem có đúng nhƣ độ dài của sản phẩm trƣớc khi tạo dòng hay không.
Plasmid pTZ57R/T có độ dài khoảng 2886bp. Tại hai đầu của vùng tiếp nhận DNA ngoại lai, ngƣời ta đã bố trí hai điểm cắt của enzym giới hạn EcoRI
Vị trí cắt của enzym EcoRI: 5'... G|AATTC...3' 3'...CTTAA|G...5'
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
băng có độ dài khoảng 2886bp của chính DNA plasmid, băng kia sẽ cho độ dài tƣơng ứng với sản phẩm PCR (với điều kiện trong chuỗi DNA của PCR không có điểm cắt khác của EcoRI). Nếu trong đó có một hay vài điểm cắt
EcoRI, thì độ dài của PCR khi kiểm tra sẽ bằng tổng số băng cộng lại. Từ đó biết đƣợc: 1) PCR có đƣợc tạo dòng hay không; 2) Độ dài của sản phẩm đƣợc tạo dòng là bao nhiêu và ƣớc định có phải của PCR mong muốn hay không; 3) Từ đó, có nên tiến hành giải trình tự để biết chính xác chuỗi nucleotid hay không.
Tiến hành cắt kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp
Bảng 2.6. Thành phần của phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzym EcoRI
Tên hóa chất Thể tích (µl)
Nƣớc tinh khiết 16
Dung dịch đệm của enzym Tago chemthem BamHI 2
Enzym EcoRI 1
DNA plasmid tái tổ hợp 1
Tổng thể tích 20
Hỗn hợp phản ứng trên đƣợc trộn đều trong một ống e ppendorf và ủ ở 370C trong 2 giờ cho phản ứng xảy ra . Điện di kiểm tra trên thạch agarose 1%, nếu có đoạn DNA cần thiết chèn vào vector , chúng ta sẽ tiến hành giải trình tự gen cần xác định.
Giải trình tự và xử lý số liệu
Giải trình đƣợc thực hiện trên máy giải trình t ự động . Trình tự chuỗi nucleotide đƣợc xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng trên máy tính. So sánh đối chiếu và xử lý số liệu của các trình tự thu nhận đƣợc với các trình tự
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
có trong Ngân hàng gen quốc tế (GenBank) bằng chƣơng trình Bioedit. Thành phần amino acid đƣợc thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã di truyền.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN