1 Bộ điện di
2 Máy li tâm lạnh
3 Bể ủ nhiệt Water bath
4 Cân điện tử
5 Máy PCR Master cycler X50s
6 Máy đồng hoá mẫu
7 Máy ly tâm Spindown mini
8 Máy Vortex Mixer
9 Máy soi gel UVP
10 Lị vi sóng
11 Tủ lạnh
12 Micropipette
3.2.3. Hoá chất
Các hoá chất cần trong phân tích sinh học phân tử đều năm ở dạng tinh khiết. danh sách các hố chất được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4: Danh mục các loại hoá chất sử dụng trong đề tàiSTT STT 1 Ethanol 2 QG buffer 3 Isopropanol 4 Phenol 5 Chloroform 6 Isoamin alcohol 7 Sodium acetat 8 Lysis buffer
10 Mecapton ethanol
11 Trisbase
12 DNA Loading dye
13 Agarose 14 Ethidium bromide 15 DNA ladder 16 PCR 5X Buffer 17 dNTPs 18 MgCl2
19 Go Taq DNA Polymerase
20 Water PCR
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1 : So sánh đặc điểm hình thái của các giống cam nghiên cứu
- Nội dung 2 : So sánh giữa cam Bố Hạ với các giống cam, quýt thu thập được
bằng chỉ thị phân tử.
- Nội dung 3 : Xác định được mối quan hệ di truyền của cam Bố Hạ với các
giống cam và quýt thu được.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp đánh giá hình thái
3.4.1.1. Đo kích thước lá
- Đo chiều rộng và chiều dài của lá cam, quýt (cm): Các lá được thu thập trên cây tại vườn, trên mỗi cây thu nhận 5 lá. Dùng thước đo chiều dài của lá, chiều rộng của lá.
3.4.1.2. Đánh giá đặc điểm hình thái hoa
- Số cánh: Đếm số cánh hoa/5 hoa/mỗi dịng, giống thí nghiệm. - Chiều dài cánh: Đo chiều dài của mỗi cánh hoa.
- Chiều dài chỉ nhị: Đo chiều dài chỉ nhị của các bông hoa thu được. - Số nhuỵ: Đếm số nhuỵ/hoa.
- Chiều dài nhuỵ: Đo chiều dài nhuỵ/bông.
- Số nhị hoa: Đếm số nhị hoa, thu 5 hoa của mỗi dịng/giống, đếm tổng số chỉ nhị và tính trung bình số chỉ nhị.
3.4.1.3 Đánh giá các chỉ tiêu của quả
- Đặc điểm hình dáng của quả, kích thước quả đạt được, đường kính quả, chiều cao quả, số múi, số hạt. Tiến hành đo quả thu thập được, tính trung bình chung các chỉ tiêu.
+ Đo chiều cao quả (cm): Dùng thước panme đo từ đỉnh quả đến gốc quả theo chiều song song với quả.
+ Đường kính quả (cm): Dùng thước panme đo ở chiều ngang của quả. + Số múi (múi/quả): Đếm số múi của các quả/tổng số quả tách múi. + Số hạt: Đếm tổng số hạt của quả/tổng số quả tách hạt.
- Khối lượng thịt quả ăn được: tách vỏ quả của các dòng/giống, cân khối lượng của phần thịt quả ăn được.
3.4.1.4. Đánh giá hạt đa phôi của cam, quýt trong nghiên cứu - Phương pháp đánh giá
+ Dùng quả đã chín tiến hành bóc tách vỏ, múi, thịt, hạt thành các phần rêng biệt, thu hạt, rửa sạch (để ráo nước), tiến hành bóc hạt vỏ cứng và vỏ lụa của hạt, đếm số phơi/hạt. Hạt đơn phơi là hạt có 1 phơi/hạt, hạt đa phơi là hạt có nhiều phơi/hạt.
- Chỉ tiêu đánh giá
+ Tính tỷ lệ hạt đơn phôi Tỷ lệ hạt đơn phôi (%) = Số hạt đơn phơi ×100
Số hạt đạt được
+ Tính tỷ lệ hạt đa phơi Tỷ lệ hạt đa phôi (%) = Số hạt đa phơi ×100
Số hạt đạt được
- Xác định số hạt đơn phơi của các dịng/giống cam, qt trong nghiên cứu. - Xác định số hạt đa phơi của các dịng/giống cam, qt trong nghiên cứu. - Xác định số hạt đơn phơi, đa phơi của các dịng/giống cam quýt.
- Xác định được tỷ lệ hạt đơn phôi và đa phôi của cam, quýt.
- Xác định số phơi có trong hạt đa phơi của các dịng/giống cam, qt trong nghiên cứu.
3.4.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số.
Các mẫu lá cam, quýt thu thập được tách chiết DNA tổng số dựa trên phương pháp của Dolye và Dolye (1987) có một vài biến đổi nhỏ để phù hợp hơn với phịng thí nghiệm.
Các bước tiến hành:
Bước 1: Cân 0,5g mẫu lá, rửa sạch và cắt nhỏ đưa vào ống effendorft 2ml. Bước 2: Bổ sung 1ml Lysisbuffer, đưa mẫu đi nghiền trong máy nghiền mẫu. Bước 3: Ủ mẫu trong bể ủ ở 65ºC trong 60 phút (10 phút vortex 1 lần). Bước 4: Ly tâm 10 phút/12000 vịng
Thu 500-600µl dịch nổi vào ống effendorft 2ml.
Bước 5: Bổ sung 1ml CIAA (Phenol cloropome isoamin) 1:1 với mẫu. Lắc mạnh tạo thành dạng sữa.
Bước 6: Ly tâm 13000 vịng/15 phút.
Hút 500-600µl dich nổi sang ống effendorft 1,5 ml. Bước 7: Bổ sung 500µl Isopropanol, 50µl Sodium. Đảo trộn nhẹ Bước 8: Ủ (-20ºC) trong 120 phút (hoặc qua đêm).
Bước 9: Ly tâm 12000 vòng/30 phút, loại bỏ dịch nổi. Spindown, hút loại bỏ nốt dịch nổi.
Bước 10: Bổ sung 1ml ETOH 70%, Vortex, Ly tâm 12000 vòng/ 2 phút. Loại bỏ cồn, Spindown, hút nốt cồn, để khơ tự nhiên.
Bước 11: Bổ sung 200µl TE 1x để hồ tan DNA. Bước 12: Hút lấy dung dịch sang ống effendorf khác.
3.4.3. Phương điện di trên gel
Các bước tiến hành:
Bước 1: Cân 1g agarose, 100ml TAE 1X, đun sơi đến khi agarose hồ tan hết. Bước 2: Bổ sung 10µl ethidium promide vào gel đã đun sơi, lắc đều.
Bước 3: Chuẩn bị khuôn đổ gel (khuôn, lược, khay), đổ gel vào khuôn đã chuẩn bị.
Bước 4: Gel khô, rút lược ra khỏi gel, đưa khay gel ra ngoài thuẹc hiện tra mẫu.
Bước 5: Tra mẫu vào gel với tỉ lệ 10µl mẫu: 2µl loading dye. Bước 6: Đưa gel vào bể điện di, chờ kết quả.
Bước 7: đưa gel lên máy soi gel và đọc kết quả.
3.4.4. Phương pháp RAPD
Phản ứng RAPD được tiến hành đối với các mồi ngẫu nhiên . Thành phần của mỗi phản ứng PCR bao gồm như sau:
PCR 5X buffer: MgCL2 :
dNTPs :
Primer (10µM):
Taq DNA polymerase: DNA khn:
H2O:
Điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau: - Giai đoạn biến tính ban đầu: 95ºC trong 5 phút.
- Giai đoạn khuếch đại gồm 40 chu kỳ gồm 3 bước sau: + Biến tính: 95ºC trong 1 phút.
+ Gắn mồi: 35ºC trong 1 phút.
+ Kéo dài mồi: 72ºC trong 2 phút.
- Giai đoạn kéo dài cuối cùng: 72ºC trong 5 phút.
- Ủ bảo quản ở: 10 ºC
3.4.5. Phương pháp phân tích đa hình
Các sản phẩm PCR- RAPD sau khi được khuếch đại và điện di trên gel agarose sẽ cho xuất hiện các băng vạch sáng. Băng sáng ở mẫu này nhưng không xuất hiện ở mẫu khác được gọi là phân đoạn đa hình, băng giống nhau ở tất cả các mẫu được coi là phân đoạn đồng hình.
3.5. Các phương pháp xử lý số liệu
Dựa trên kết quả của các phân đoạn DNA khi điện di sản phẩm PCR- RAPD và PCR- ISSR của các mẫu cam, quýt thu được với các đoạn mồi ngẫu nhiên để làm cơ sở phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.0 theo quy ước :
+ Số 0: Không xuất hiện các đoạn DNA + Số 1: Xuất hiện các đoạn DNA
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1. Kết quả mơ tả hình thái của các dịng cam, qt
4.1.1. Hình thái lá
- Lá cam có màu xanh đậm, các gân lá chìm, mép lá có răng cưa khơng sắc, có eo lá nhỏ và cuống lá hơi có cánh (tuỳ vào lá sẽ có độ to nhỏ khác nhau).
Trong nghiên cứu này, đã đánh giá đặc điểm về hình thái, kích thước, màu sắc