Dựa trên kết quả của các phân đoạn DNA khi điện di sản phẩm PCR- RAPD và PCR- ISSR của các mẫu cam, quýt thu được với các đoạn mồi ngẫu nhiên để làm cơ sở phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.0 theo quy ước :
+ Số 0: Không xuất hiện các đoạn DNA + Số 1: Xuất hiện các đoạn DNA
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1. Kết quả mô tả hình thái của các dòng cam, quýt
4.1.1. Hình thái lá
- Lá cam có màu xanh đậm, các gân lá chìm, mép lá có răng cưa không sắc, có eo lá nhỏ và cuống lá hơi có cánh (tuỳ vào lá sẽ có độ to nhỏ khác nhau).
Trong nghiên cứu này, đã đánh giá đặc điểm về hình thái, kích thước, màu sắc của hoa, nhị và nhụy của các dòng/giống cam Bố Hạ. Kết quả được thể hiện trong bảng 4.1 dưới đây:
Bảng 4.1: Hình thái lá ở cam Dòng/Giống
Cam chanh CBH Cam chanh Chín Muộn Cam chanh Chín Sớm Cam sành CS1 Cam sành CS2 Cam sành CS4 Cam sành CS5 Cam sành CS7 Cam Hàm Yên SO Cam Hàm Yên C36 Cam Hàm Yên MVL Xã Đoài cao Phong Xã Đoài Nghệ An Cam sành Hưng Yên Quýt Ngọt
Kết quả CV%, LSD được thể hiện ở bảng phụ lục 2.
Kết quả thể hiện ở bảng 4.1 cho thấy, lá của các dòng/giống cam nghiên cứu đều có màu xanh đậm, phiến lá dài, mọc so le, có gân lá chìm. Ở hầu hết các mẫu lá có viền răng cưa nhẹ trừ Cam sành CS1, cam sành CS7, quýt Chín sớm và quýt Ôn Châu không có răng cưa tại viền. Tất cả lá của các mẫu có độ cong nhẹ. lá có eo lá
nhỏ và có cánh lá nhỏ ở một số dòng/giống cam chanh CBH, cam sành (CS1, CS2, CS4, CS5, Hưng Yên), cam Xã Đoài Cao Phong, cam Hàm Yên (C36, MVL, SO), quýt (Chín sớm, chín muộn). Một số mẫu còn lại như XĐNA, quýt ngọt, quýt Cam canh, quýt Ôn Châu không có. Chiều dài của lá dao động trong khoảng từ 8 đến 12cm, chiều rộng trung bình trên mỗi lá dao động trong khoảng từ 3 đến 6 cm, hình dáng lá bầu dục ở một số mẫu như: Cam sành (CS1, CS2, CS4, CS5, CS7), cam chanh CBH, cam XĐCP, cam sành Hưng Yên, quýt (chín muộn, chín sớm, ôn châu, cam canh) và cam Hàm Yên; một số lại có hình ngọn giáo như quýt ngọt, XĐNA. Trong nghiên cứu này dòng cam chanh, Bố Hạ, cam Hàm Yên, quýt Chín Sớm có lá to hơn các dòng cam, quýt còn lại.
Hình 4.1. Hình thái của lá mặt trên (A) và mặt dưới (B) của các dòng/giống cam, quýt
Ghi chú: a: Cam chanh CBH b: Cam sành CS1 c: Cam sành CS2 d: Cam sành CS4
4.1.2. Hình thái hoa
Hoa là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong phân loại thực vật. Trong nghiên cứu này, đã đánh giá đặc điểm về hình thái, kích thước, màu sắc của hoa, nhị và nhụy của các dòng/giống cam Bố Hạ. Kết quả được thể hiện trong bảng 4.2 dưới đây:
Bảng 4.2. Hình thái hoa ở cam
Dòng/giống Cam chanh CBH Cam sành CS1 Cam sành CS2 Cam sành CS4 Cam sành CS5 Cam Hàm Yên Cam Xã Đoài
Kết quả CV%, LSD được thể hiện ở phụ lục 2.
Kết quả thể hiện ở bảng 4.2 cho thấy, hoa của các dòng/giống cam nghiên cứu đều có 5 cánh, màu trắng ngà, có nhiều đốm vàng nâu, có 1 nhụy, bầu trên. Chiều dài cánh hoa dao động trong khoảng 1,2 đến 2,03 cm. Số chỉ nhị trung bình trên mỗi hoa dao động trong khoảng từ 19 đến 27 chỉ nhị, chỉ nhị màu trắng, bao phấn màu vàng tươi.
cam Hàm Yên là 23,5 và cam Xã Đoài là 27,1.
Về vị trí của hoa trên cây: Ở tất cả các dòng/giống nghiên cứu đều có các dạng hoa đơn và hoa chùm trên cùng 1 cây, hoa có thể mọc ở đỉnh ngọn cành hoặc mọc ở nách lá trên cành.
Hình 4.2. Hình thái và vị trí của hoa cam nghiên cứu
A.Hình thái và kích thước hoa cam chanh CBH, B. Hình thái và kích thước cam sành CS1, C. Hình thái và kích thước hoa cam sành CS5, D. Vị trí của
hoa trên cành
4.1.3. Hình thái quả
Các đặc điểm hình thái của quả và hạt được đánh giá ở bảng 4.3
Bảng 4.3. Hình thái của quả và hạt
Tên dòng/giống CS5 CS1 CBH Hàm Yên
Hình 4.3. Hình thái và vị trí của quả cam nghiên cứu
A. Hình thái quả cam chanh CBH, B. Hình thái quả cam sành CS5, C. Hình thái quả cam sành CS1, D. Hình thái quả cam Hàm Yên SO
E. Hình ảnh vị trí quả trên cành (đỉnh và nách); quả chùm, quả đơn
Kết quả nghiên cứu về đặc điểm của quả cho thấy, cam sành Bố Hạ có quả hình cầu dẹt, túi tinh dầu thô hiện rõ, đỉnh quả và đáy quả bằng, hơi lõm, vỏ quả khi chín màu vàng thẫm sáng dòn. Thịt quả màu vàng đậm, vách múi dai, dễ tách, lõi quả đặc và nhiều hạt. Cam sành hàm Yên có đặc điểm quả hình cầu dẹt, túi tinh dầu chìm hơn, đỉnh quả lõm, vỏ quả khi chín có màu vàng đậm, ruột quả màu vàng sậm, vách múi dai, dễ tách, lõi quả đặc và nhiều hạt nhiều hạt. Về kích thước và khối lượng, quả cam Hàm Yên có kích thước lớn hơn so với cam sành Bố Hạ (khối lượng trung bình là 220,65g so với 123,0 g của cam CS5 và 92,91g của cam SC1). Số múi/quả của giống cam sành Hàm Yên và cam sành Bố Hạ tương đương nhau. Về số hạt/quả: Cam sành Hàm Yên có số lượng hạt ít nhất (trung bình là 15 hạt/quả) nhưng chủ yếu là hạt mảy, kích thước hạt lớn, số lượng hạt lép trung bình là 1 hạt/quả.
Cam chanh Bố Hạ: Quả hình cầu hơi tròn, túi tinh dầu chìm nên vỏ quả nhẵn hơn so với cam sành Bố Hạ và cam sành Hàm Yên, đỉnh quả và đáy quả bằng. Vỏ quả khi chín màu vàng thẫm sáng dòn. Thịt quả màu vàng sáng, vách múi dai, dễ tách, lõi quả đặc và nhiều hạt. Số lượng hạt trung bình/quả là 26 hạt trong đó có 20
hạt mảy và 6 hạt lép, kích thước hạt lớn, hình thái gần giống hạt bưởi. Quả cam chanh có mùi thơm.
Như vậy, về đặc điểm hình thái quả cho thấy, cam sành Bố Hạ có đặc điểm sai khác với cam sành Hàm Yên về hình thái đỉnh quả, khối lượng quả, màu sắc của ruột quả, số lượng hạt lép/quả. Cam chanh Bố Hạ, có đặc điểm quả, đặc điểm hạt khác biệt so với cam sành Bố Hạ và cam sành Hàm Yên.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục đánh giá đặc điểm về tỷ lệ hạt đơn phôi, đa phôi của các dòng/giống cam nghiên cứu. Kết quả xác định số lượng hạt đơn phôi, đa phôi được tổng hợp tại bảng 4.4 và số phôi trung bình/hạt đa phôi được thể hiện trọng bảng 4.5.
Bảng 4.4. Bảng đánh giá số hạt của quả Tên dòng/giống
Cam chanhCBH Cam Hàm Yên Cam sành CS1 Cam sành CS5
Kết quả nghiên cứu số hạt đơn phôi, đa phôi của các dòng/giống cam nghiên cứu thể hiện trong bảng 4.4 cho thấy, các dòng/giống cam nghiên cứu đều có hạt đơn phôi và hạt đa phôi. Số hạt đa phôi/quả của giống cam chanh bố Hạ CBH cao nhất (17,5 hạt/quả) sau đó đến cam sành Hàm Yên (13,6 hạt/quả). Cam sành Bố Hạ có tỷ lệ hạt đơn phôi thấp hơn (7,0 hạt/quả ở cam sành CS1 và 10,5 hạt/quả ở cam sành CS5).
Bảng 4.5. Đánh giá số phôi trong cam Tên dòng/giống CS1 CS5 CBH Hàm Yên
Kết quả thể hiện trong bảng 4.5 cho thấy, số phôi trung bình/hạt đa phôi của cam chanh Bố Hạ CBH cao nhất (trung bình 3,7 phôi/hạt đa phôi), sau đó là cam sành Hàm Yên (3,7 phôi/hạt đa phôi). Cam sành bố Hạ CS5 có số phôi/hạt đa phôi trung bình thấp nhất, 2,9 phôi/hạt đa phôi. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, ở cam sành Hàm Yên, cam sành CS5 các hạt có 2 phôi đến 5 phôi là chủ yếu, nhiều nhất là hạt 2 có 2 phôi. Cam sành CS1 chủ yếu là hạt có 2 – phôi (38 hạt) còn cam chanh Bố Hạ CBH các hạt có 3-4 phôi chiếm tỷ lệ cao nhất.
Như vậy, qua kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái của cam Bố Hạ và một số dòng/giống cam nghiên cứu cho thấy, cam sành và cam chanh Bố Hạ đều thuộc dạng lá đơn, có eo lá nhỏ, cuống ngắn, phiến lá hình ovan, mép lá có răng cưa hơi gợn sóng, mút lá hơi nhọn, lá màu xanh đậm. Lá cam sành có mặt lá hơi cong, lá cam chanh có mặt lá phẳng, lá mỏng hơn so với lá cam sành. Về đặc điểm hoa: hoa cam sành và hoa cam chanh Bố Hạ đều mang đặc trưng của hoa cam, hoa 5 cánh bầu trên, màu trắng ngà, có 1 nhị, số chỉ nhị 19 – 23 nhị/hoa, bao phấn màu vàng tươi; hoa chùm hoặc hoa đơn, mọc ở đỉnh hoặc ở nách. Về đặc điểm quả, cam sành Bố Hạ có quả hình cầu dẹt, túi tinh dầu thô hiện rõ, đỉnh quả và đáy quả bằng, hơi lõm, vỏ quả khi chín màu vàng thẫm sáng dòn. Thịt quả màu vàng đậm, vách múi dai, dễ tách, lõi quả đặc và nhiều hạt. Cam chanh Bố Hạ: Quả hình cầu hơi tròn, túi tinh dầu chìm nên vỏ quả nhẵn hơn so với cam sành Bố Hạ và cam sành Hàm Yên, đỉnh quả và đáy quả bằng. Vỏ quả khi chín màu vàng thẫm sáng dòn. Thịt quả màu vàng sáng, vách múi dai, dễ tách, lõi quả đặc và nhiều hạt. Quả cam chanh có mùi thơm. Cam sành và cam chanh Bố Hạ đều cho hạt đơn phôi và hạt đa phôi, số phôi trung bình/hạt đa phôi
ởcam sành CS1, CS5 và cam chanh CBH lần lượt là 3,1; 2,9 và 3,7.
4.2. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền của các dòng/giống cam nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử RAPD và ISSR cứu bằng chỉ thị phân tử RAPD và ISSR
4.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá cam, quýt
Để đánh giá đa dạng di truyền của các dòng/giống cam nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử, các mẫu lá cam, quýt thu thập được tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp hóa chất. Mẫu tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số được thể hiện trong hình 4.4.
Hình 4.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA
tổng số của các mẫu cam, quýt nghiên cứu Ghi chú: Đường chạy M thang chuẩn DNA 100 bp;
các đường chạy từ 1-20: các mẫu DNA tổng số
Kết quả điện di cho thấy, các đường chạy đều cho một số băng DNA sáng, gọn
( XĐCP, CBH1, C36, SO1, CHS, MVL, SO16, SO19, SO6, SO32, CBH5, CS1, CS4, QN, XĐNA) và một số băng mờ (CMV, CC, OC, HY, CS5), không có băng phụ chứng tỏ đã tách chiết được DNA tổng số của các mẫu cam, quýt nghiên cứu, sản phẩm DNA không bị đứt gãy, hàm lượng cao, đủ điều kiện để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp theo. Các dung dịch DNA tổng số được bảo quản ở -20oC phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
4.2.2. Kết quả phân tích đa hình các dòng/giống cam sử dụng các chỉ thị mồi ISSR
và RAPD
- Mồi OPT – 01
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mồi OPT-01 được thể hiện trong hình 4.5 dưới đây:
Giếng 1: XĐCP Giếng 2: CMV Giếng 3: CC Giếng 4: OC Giếng 5: HY
Kết quả cho thấy, với mồi OPT-01 chỉ có 2 mẫu có hình thành sản phẩm PCR gồm các mẫu C36 và mẫu CS4. Trong đó, mẫu C36 hình thành 4 băng DNA có kích thước 200bp và mẫu CS4 hình thành 2 băng DNA có kích thước 350bp. Các mẫu còn lại không xuất hiện băng DNA vậy mồi OPT-01 không thể hiện tính đa hình với các mẫu trên.
- Mồi OPA – 04
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mồi OPA-04 được thể hiện trong hình 4.6 dưới đây:
Hình 4.6: Kết quả điện di kiểm tra PCR với mồi OPA – 04
Ghi chú: Giếng M: Marker Giếng 1: XĐCP Giếng 2: CMV Giếng 3: CC Giếng 4: OC Giếng 5: HY
Kết quả cho thấy, với mồi OPA-04 có 16 mẫu có hình thành sản phẩm PCR gồm các mẫu XĐCP, CMV, OC, HY, CBH1, C36, SO1, CHS, MVL, SO16, SO19, SO32, CS1, CS5, CS4, XĐNA. Trong đó, các mẫu (C36, SO32, CS4, MVL) hình thành 2 băng DNA có kích thước 200bp; các mẫu (XĐCP, CMV, OC, HY, CHB1, CHS, CS1, SO19, CS5) hình thành 3 băng DNA có kích thước 200bp; các mẫu (SO1, SO16) hình thành 1 băng DNA có kích thước 600bp; mẫu (XĐNA) hình thành 1 băng có kích thước 750bp. Các mẫu còn lại không hình thành băng DNA vậy mồi OPA-04 không thể hiện tính đa hình với các mẫu nghiên cứu trên.
- Mồi OPA – 08
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mồi OPA-08 được thể hiện trong hình 4.7 dưới đây:
Hình 4.7: Kết quả điện di PCR với mồi OPA – 08
Ghi chú: Giếng 1: XĐCP Giếng 2: CMV Giếng 3: CC Giếng 4: OC Giếng 5: HY Giếng 6: CBH1
Kết quả cho thấy, với mồi OPA-08 có 12 mẫu có hình thành sản phẩm PCR gồm các mẫu XĐCP, CMV, CC, OC, HY, CH1, C36, SO16, SO19, SO6, CBH5. Trong đó, mẫu (CC, CBH5) hình thành 2 băng DNA có kích thước 300bp; mẫu (XĐCP) có hình thành 4 băng DNA có kích thước 100bp; mẫu (CMV, CBH1, C36) hình thành 3 băng có kích thước 300bp; mẫu (HY) hình thành 3 băng với kích thước 400bp; ở các mẫu (OC, SO16, SO19, SO6) hình thành lên 1 băng DNA với
kích thước của OC là 500bp và các mẫu SO16, SO19, SO6 có kích thước là 300bp; mẫu (SO32) hinh thành 3 băng DNA với kích thước 150bp. Các mẫu (SO1, CHS, MVL, CS1, CS5, CS4, QN, XĐNA) không xuất hiện băng vạch DNA vậy mồi OPA- 08 không thể hiện tính đa hình với các mẫu nghiên cứu trên.
- Mồi OPG – 17
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mồi OPT-01 được thể hiện trong hình 4.8 dưới đây
Hình 4.8: Kết quả điện di PCR- mồi OPG – 17
Ghi chú: Giếng M: Marker Giếng 1: XĐCP Giếng 2: CMV Giếng 3: CC Giếng 4: OC Giếng 5: HY
Kết quả cho thấy, với mồi OPG-17 có 19 mẫu có hình thành sản phẩm PCR gồm các mẫu (XĐCP, CMV, CC, OC, HY, CBH1, C36, SO1, CHS, MVL, SO16, SO19, SO6, SO32, CBH5, CS1, CS5, CS4, QN). Trong đó, mẫu (CMV, CC) hình thành 3 băng DNA có kích thước 400bp; mẫu (CS1) hình thành 2 băng DNA có kích thước 350bp; các mẫu (CBH1,C36, CHS, MVL) hình thành 7 băng DNA với kích thước 300bp; các mẫu (HY, SO1, SO16) hình thành lên 8 băng DNA với kích thước 320bp; các mẫu (SO32, CS4) hình thành 4 băng DNA với kích thước 500bp; các mẫu (SO19, CBH5, QN) hình thành 2 băng DNA với kích thước 800bp; mẫu (SO6) hình thành 1 băng DNA với kích thước 1000bp; mẫu (CS5) hình thành 5
băng DNA với kích thước 550bp; mẫu OC hình thành 3 băng DNA với kích thước 300bp; mẫu XĐCP hình thành 6 băng với kích thước 300bp. Mẫu XĐNA không xuất hiện băng DNA vậy mồi OPG-17 không thể hiện tính đa hình với các mẫu nghiên cứu trên.
- Mồi OPM – 13
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mồi OPM- 13 được thể hiện trong hình 4.9 dưới đây.
Hình 4.9: Kết quả điện di PCR- mồi OPM – 13
Ghi chú: Giếng M: Marker Giếng 1: XĐCP Giếng 2: CMV Giếng 3: CC Giếng 4: OC Giếng 5: HY
Kết quả điện di PCR của 20 mẫu cam, quýt với mồi OPM-13 cho ta thấy 0 có phân đoạn DNA nào được khuếch đại. Với kết quả thu được ta thấy mồi OPM-13 không thể hiện tính đa hình với các mẫu nghiên cứu trên.
- Mồi OPC – 08
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mồi OPC-08 được thể hiện trong hình 4.10 dưới đây:
Kết quả cho thấy, với mồi OPC-08 có 8 mẫu có hình thành sản phẩm PCR gồm các mẫu XĐCP, CMV, HY, CBH1, C36, MVL, CS4, QN. Trong đó, mẫu XĐCP hình thành 3 băng DNA có kích thước 750bp; mẫu CMV hình thành 1 băng DNA có kích thước 750bp; mẫu HY hình thành 5 băng DNA có kích thước 150bp; mẫu CBH1 hình thành 2 băng DNA có kích thước 300bp; mẫu C36 hình thành 1
vạch có kích thước 500bp; mẫu MVL hình thành 4 vạch có kích thước 200bp; mẫu CS4 hình thành 3 băng có kích thước 200bp; mẫu QN hình thành 1 băng có kích