3.4.1. Phương pháp chuẩn bị mẫu phân tích từ mô thực vật
Mẫu phân tích là mẫu lá được chuẩn bị theo phương pháp của Bar-Joseph M. và cộng sự năm 1979 [10] với biến đổi nhỏ để phù hợp với phòng thí nghiệm. Các bước tiến hành như sau:
- Bước 1: Lấy 0,2 g mẫu lá cam, quýt, cắt nhỏ và cho vào ống eppendorf loại 2ml mới, vô trùng. Bổ sung vào mỗi ống eppendorf 2 viên bi inox và 1.200 µl dung
dịch đệm tách chiết. Đặt eppendorf chứa mẫu vào máy đồng hóa, nghiềm mẫu 3 chu kỳ, mỗi chu kỳ 30 giây ở tốc độ 4.000 vòng/phút để thu được dung dịch đồng nhất.
- Bước 2: Ly tâm mẫu ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 phút, ở nhiệt độ
10oC.
- Bước 3: Dùng micropipet chuyển phần dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml
mới.
- Bước 4: Bảo quản mẫu ở nhiệt độ 4oC để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
Lưu ý: Chỉ chuẩn bị mẫu ngay trước khi tiến hành thực hiện phản ứng ELISA, không chuẩn bị mẫu trước quá 1 ngày.
3.4.2. Phương pháp ELISA
Kỹ thuật ELISA phát hiện bệnh tristeza được thực hiện theo quy trình của Borah M. và cộng sự năm 2014 [12] có sự thay đổi nhỏ. Quy trình cụ thể như sau:
Bước 1: Chuẩn bị kháng thể bắt giữ đặc hiệu
- Pha loãng kháng thể bắt giữ (Capture antibody) của hãng Agritest trong dung dịch đệm Coating buffer theo tỷ lệ 1:500 (v/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Bổ sung 200 µl kháng thể bắt giữ đặc hiệu đã được pha loãng vào mỗi giếng.
- Ủ ở 37oC trong 2h. Để cố định kháng thể vào giếng
- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong các giếng.
- Chuẩn bị mẫu phân tích thu được như ở trên và mẫu kiểm chứng của hãng Agritest (Ý).
- Bổ sung 200 µl/giếng dung dịch mẫu phân tích. - Ủ đĩa ELISA 2h - 4h ở 37oC.
- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong các giếng.
- Pha loãng kháng thể cộng hợp enzyme (Conjugate antibody) của hãng Agritest trong dung dịch đệm Conjugate buffer theo tỷ lệ 1:500 (v/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong các giếng.
Bước 4: Thêm cơ chất
- Pha loãng cơ chất p-nitrophenil phosphate trong dung dịch đệm Substrate buffer theo tỷ lệ 1/10 (m/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Bổ sung 200 µl cơ chất vào giếng.
- Ủ ở nhiệt độ phòng đến khi phát ra tín hiệu nhận biết có thể quan sát bằng mắt
thường (khoảng 1-3h).
Bước 5: Kiểm tra kết quả
Quan sát tín hiệu màu phát ra ở các giếng bằng mắt thường, so sánh với kết của các mẫu đối chứng dương tính, âm tính. Có thể ngừng phát tín hiệu bằng cách thêm vào mỗi giếng 50 µl NaOH 3M.
3.4.3. Phương pháp tính độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật ELISA
Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật ELISA so với phương pháp kiểu hình được tính theo công thức của Walker H.K [27] như sau:
Số mẫu dương tính thật x 100 Độ nhạy (%) =
Số mẫu dương tính thật + số mẫu âm tính giả
Số mẫu âm tính thật x 100 Độ đặc hiệu (%) =
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh Tristeza trên cây cam, quýt
Để thực hiện đề tài nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thu thập 20 mẫu cam quýt tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Bảng 4.1. Các mẫu cam, quýt thu thập được
STT Ký hiệu mẫu 1 CBH -1 2 CBH -2 3 CS1-1 4 CS2-1 5 CS4-1 6 CS5-1 7 CS0-1 8 CC1 9 CC2 10 QN4 11 V2-1 12 V2-2 13 V2-3 14 V2-4 15 V2-5 16 V2-6 17 V2-7 18 V2-8
Trong 20 mẫu cam quýt sử dụng cho nghiên cứu có 10 mẫu thu thập tại vườn cam sản xuất của trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên và 10 mẫu thu tập tại vườn sưu tập giống cam quýt Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm.
Mười trong số 20 mẫu thu thập mang kiểu hình bị bệnh tristeza như: lá vàng, kích thước nhỏ, cong, biến dạng, gân lá trong, mờ khi đưa lên ánh sáng và gân chính lõm, gân phụ sưng lên, khi tác nhân gây bệnh lây lan đến đâu sẽ gây khô và chết cành, cây. Cây bị bệnh nặng thân bị lõm khi bóc vỏ. Mười mẫu còn lại có kiểu hình bình thường, không biểu hiện bệnh.
Hình 4.1. Hình ảnh cây bị cam bị nhiễm bệnh tristeza ở các mức độ khác nhau (A); Lá cây cam bị bệnh tristeza và lá bình thường (B) tại vườn sản xuất, trường
Đại học Nông Lâm
4.2. Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật ELISA phát hiện bệnhTristeza trên cây có múi Tristeza trên cây có múi
Để xây dựng được quy trình kỹ thuật ELISA phát hiện bệnh tristeza trên cây cam, quýt cần phải tìm hiểu các điều kiện phù hợp ở từng bước của quy trình bao gồm: phương pháp chuẩn bị mẫu, hàm lượng BSA sử dụng, điều kiện rửa, thời gian ủ cơ chất, thời gian ủ mẫu phân tích và nồng độ mẫu tối thiểu cho phản ứng ELISA. Dưới đây là kết quả nghiên cứu thử nghiệm ảnh hưởng của các yếu tố này đến khả năng phát hiện bệnh tristeza.
4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chuẩn bị mẫu phân tích
Mẫu lá được nghiền trong điều kiện thông thường và điều kiện lạnh sau đó được sử dụng làm mẫu phân tích cho quy trình ELISA, đánh giá hiệu quả của kỹ thuật thông qua cường độ màu hình thành giữa giếng chứa mẫu bị bệnh, mẫu kiểm chứng dương tính và mẫu kiểm chứng âm tính ở các cây bị bệnh. Kết quả của 2 thí nghiệm được thể hiện ở hình 4.2 dưới đây:
Hình 4.2. Kết quả phát hiện bệnh tristeza bằng kỹ thuật ELISA ở các điều kiện tách chiết mẫu khác nhau: TN1. Mẫu được chuẩn bị
ở điều kiện thường, TN2. Mẫu được chuẩn bị ở điều kiện lạnh
Kết quả thể hiện trong hình 4.2 cho thấy:
Khi mẫu được tách chiết ở nhiệt độ thường (nhiệt độ phòng thí nghiệm), mẫu kiểm chứng dương tính (hàng A, cột 1, TN1) cho cường độ màu vàng cao hơn so với mẫu kiểm chứng âm tính (hàng B, cột 1, TN1). Kết quả này hoàn toàn phù hợp. Tuy nhiên, ở các mẫu bị bệnh (hàng C đến hàng G, cột 1 và cột 2, TN1) cho tín hiệu màu không đều. Ở giếng C, cột 1, giếng D, cột 2 và giếng F, cột 1 có cường độ màu cao hơn so với mẫu kiểm chứng âm tính là phù hợp với kết quả kiểu hình bị bệnh nhưng các giếng còn lại có cường độ tín hiệu màu tương đương với mẫu kiểm chứng âm tính. Đây là những kết quả âm tính giả, không đúng với kết quả kiểu hình bị bệnh. Điều này chứng tỏ rằng: chuẩn bị mẫu ở nhiệt độ phòng thí nghiệm cho kết quả phân tích không ổn định. Lý do giải thích cho điều này có thể là khi đồng hóa trong điều kiện thông thường, một hàm lượng lớn protein kháng nguyên của virus gây bệnh tristeza bị biến tính, không có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng thể.
Khi mẫu được đồng hóa trong điều kiện lạnh (đệm tách chiết được xử lý -20oC trước khi sử dụng và quá trình ly tâm mẫu được thực hiện ở 10oC), các giếng ELISA đều cho cường độ màu cao hơn so với mẫu kiểm chứng âm tính (TN2). Các kết quả này chứng tỏ các mẫu phân tích mang mầm bệnh tristeza đúng với kết quả kiểu hình.
Từ kết quả thí nghiệm này cho thấy, mẫu nên được tách chiết ở điều kiện lạnh để tránh làm biến tính protein kháng nguyên của virus gây bệnh tristeza.
4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BSA pha loãng trong đệm Conjugate buffer Conjugate buffer
Albumin huyết thanh bò (Bovine serum albumin – BSA) là protein được sử dụng nhiều trong các kỹ thuật lai phân tử với vai trò là chất blocking. BSA có khả năng liên kết vào giếng ELISA tại những vị trí không có kháng thể bắt giữ. Do đó, ngăn chặn các liên kết không đặc hiệu giữa kháng thể cộng hợp enzyme với bề mặt của giếng ELISA. Ngoài ra, BSA có tác dụng giảm bớt tín hiệu nền, tăng cường các tín hiệu lai đặc hiệu [22], [29]. Vì vậy, để tăng cường tính đặc hiệu của kỹ thuật ELISA phát hiện bệnh tristeza chúng tôi tiến hành thử nghiệm nồng độ BSA được bổ sung vào trong đệm cộng hợp (conjugate buffer). Kết quả được thể hiện trong hình 4.3.
Hình 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lương BSA pha loãng trong đệm Conjugate buffer. TN3: hàm lượng BSA 2,0 g/l; TN4: Hàm lượng BSA 4,0 g/l
Kết quả nghiên cứu so sánh 2 nồng độ BSA khác nhau (2,0 g/l ở TN3 và 4,0 g/l ở TN4) cho thấy: khi đệm cộng hợp được bổ sung BSA với hàm lượng 2,0 g/l (TN3 hình 4.3), không có sự khác biệt về cường độ tín hiệu màu giữa các giếng phân tích mẫu bị bệnh và mẫu không bị bệnh. Điều này chứng tỏ
hàm lượng BSA không đủ để liên kết vào các vị trí trống tại các giếng ELISA dẫn đến kháng thể cộng hợp enzyme đã liên kết không đặc hiệu vào các vị trí này làm cho tín hiệu màu của phản ứng tăng lên.
Khi thử nghiệm với hàm lượng BSA là 4,0 g/l (TN4 hình 4.3) ở các giếng phân tích các mẫu bị bệnh (cột 1) có cường độ tín hiệu màu cao hơn rõ ràng so với cường độ tín hiệu màu của mẫu kiểm chứng âm tính. Các giếng phân tích mẫu không bị bệnh (cột 2), cường độ tín hiệu màu thu được thấp hơn hoặc bằng mẫu kiểm chứng âm tính phù hợp với kết quả kiểu hình.
Kết quả này cho thấy, sử dụng nồng độ BSA 4,0 g/l trong đệm cộng hợp giúp tăng độ đặc hiệu của kỹ thuật ELISA phát hiện tristeza ở cam, quýt. Do đó, trong các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi sử dụng BSA với nồng độ 4,0 g/l.
4.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện rửa
Trong kỹ thuật ELISA, các bước rửa có vai trò đặc biệt quan trọng giúp loại bỏ các phân tử lai không đặc hiệu nhưng phải giữ được các phân tử đã được liên kết đặc hiệu tại các giếng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi thử nghiệm phương pháp rửa 4 lần, mỗi lần ngâm 3 phút trong dung dịch đệm rửa (washing buffer) và phương pháp rửa 3 lần, mỗi lần ngâm 3 phút trong dung dịch đệm rửa. Kết quả phân tích ELISA phát hiện bệnh tristeza ở 2 điều kiện rửa này được thể hiện trong hình 4.4.
Hình 4.4. Kết quả phát hiện bệnh tristeza bằng kỹ thuật ELISA ở các điều kiện rửa khác nhau. C1: Rửa 4 lần; C2: Rửa 3 lần
Kết quả thu được thể hiện trong hình 4.4 cho thấy không sự khác biệt về cường độ tín hiệu màu giữa các giếng tương ứng trong 2 cách rửa. Kết quả phân tích bằng kỹ thuật ELISA cũng phù hợp với kết quả kiểu hình. Như vậy, để giảm thời gian phân tích, chúng tôi sử dụng phương pháp rửa 3 lần, mỗi lần ngâm 3 phút trong dung dịch đệm rửa.
4.2.4. Kết quả nghiên cứu thời gian ủ cơ chất hiện màu
Trong kỹ thuật ELISA này, kháng thể phát hiện được sử dụng là loại kháng thể cộng hợp với enzyme alkaline phosphatase, cơ chất được sử dụng để phát hiện là p- nitrophenol photphate. Dưới tác dụng của alkaline phosphatase, nhóm phosphate từ alkaline phosphatase không màu sẽ bị loại bỏ tạo thành sản phẩm p-nitrophenol có màu có thể quan sát bằng mắt thường [9]. Do đó, hàm lượng p-nitrophenol photphate có thể ảnh hưởng đến sự hành thành tín hiệu màu của kỹ thuật ELISA.
Thời gian ủ cơ chất sẽ liên quan đến lượng sản phẩm p-nitrophenol được hình thành và do đó ảnh hưởng đến cường độ tín hiệu màu của phản ứng ELISA. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành theo dõi thời gian để kết quả ELISA hiển thị rõ ràng và đặc hiệu. Kết quả được thể hiện trong hình 4.5 dưới đây:
Hình 4.5. Kết quả nghiên cứu thời gian ủ cơ chất hiện màu a. 1h sau khi thêm cơ chất; b. 2h sau khi thêm cơ chất; c. 3h sau khi thêm cơ chất; d. 4h sau khi thêm
cơ chất
Kết quả trên hình 4.5 cho thấy: Sau 1h ủ cơ chất (hình 4.5a), chưa có tín hiệu màu xuất hiện ở cả mẫu kiểm chứng dương tính, mẫu kiểm chứng âm tính và các
mẫu phân tích, chứng tỏ thời gian ủ chưa đủ để enzyme chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm màu. Sau khi ủ cơ chất 2h (hình 4.5b), các giếng bắt đầu xuất hiện màu vàng nhạt, có thể quan sát bằng mắt thường tuy nhiên sự khác biệt về màu sắc giữa giếng kiểm chứng dương tính và các mẫu phân tích so với mẫu kiểm chứng âm tính chưa rõ ràng. Sau thời gian ủ 3h (hình 4.5c), tín hiệu màu xuất hiện rõ ràng, dễ nhận biết bằng mắt thường. Đồng thời, cường độ tín hiệu màu giữa mẫu kiểm chứng dương tính khác biệt hoàn toàn với mẫu kiểm chứng âm tính. Các mẫu phân tích có cường độ tín hiệu màu cao hơn hẳn so với mẫu kiểm chứng âm tính là phù hợp với kết quả phân tích của mẫu bị bệnh tristeza. Kết quả này hoàn toàn đặc hiệu. Khi tăng thời gian ủ cơ chất lên 4h (hình 4.5d), cường độ tín hiệu màu cao nhưng không có sự khác biệt giữa mẫu kiểm chứng âm tính với các mẫu còn lại. Đây là kết quả phân tích không đặc hiệu.
Từ kết quả trên cho phép kết luận rằng: trong kỹ thuật ELISA này, thời gian ủ cơ chất phù hợp nhất là 3h.
4.2.5. Kết quả nghiên cứu thời gian ủ mẫu phân tích
Thời gian ủ mẫu của phản ứng ELISA sẽ ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp của kháng nguyên với kháng thể bắt giữ (capture antibody). Để nghiên cứu ảnh hưởng này, các mẫu được ủ trong giếng ELISA trong 2h và 4h trước khi được rửa để loại bỏ các phân tử lai không đặc hiệu. Kết quả phản ứng ELISA được thể hiện trong hình 4.6 dưới đây:
Hình 4.6. Kết quả phân tích ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu phân tích a. ủ 2h; b. ủ 4h
Kết quả phân tích trên hình 4.6 cho thấy: tăng thời gian ủ cơ mẫu từ 2h lên 4h, cường độ tín hiệu màu tăng lên và hoàn toàn quan sát được bằng mắt thường. Tín hiệu màu ở mẫu kiểm chứng dương tính và mẫu phân tích đều cao hơn so với mẫu kiểm chứng âm tính là hoàn toàn đặc hiệu. Như vậy, thời gian ủ mẫu phân tích là 4h phù hợp cho kỹ thuật ELISA phát hiện tristeza được phát triển trong nghiên cứu này.
4.2.6. Kết quả nghiên cứu xác định nồng độ mẫu tối thiểu cần cho phản ứng ELISA
Để xác định nồng độ mẫu tối thiểu cần cho một phản ứng ELISA, chúng tôi sẽ tiến hành nghiền 0,2 g lá cây bị bệnh tristeza trong 1,2 ml đệm tách chiết, ly tâm thu dịch sau đó pha loãng dịch ban đầu ở các nồng độ pha loãng 2, 4, 8, 16 và 32 lần. 200 µl dung dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau được sử dụng để thử nghiệm kỹ thuật ELISA. Kết quả của phản ứng ELISA được thể hiện trong hình 4.7 như sau:
Hình 4.7. Kết quả nồng độ mẫu tối thiểu cần cho phản ứng
ELISA a. Bước ủ mẫu phân tích; b. Kết quả sau khi ủ cơ chất
Kết quả nghiên cứu thể hiện trong hình 4.7 cho thấy: khi nồng độ dung dịch mẫu càng thấp, cường độ tín hiệu màu của kỹ thuật ELISA càng thấp. Ở độ pha loãng 16 lần (giếng 1G và 2G) và 32 lần (giếng 1H và 2H), cường độ tính hiệu màu ở giếng phân tích không có sự sai khác so với cường độ tín hiệu màu ở giếng kiểm chứng âm tính (giếng 1B và 2B). Điều này chứng tỏ ở các nồng độ pha loãng 16 lần trở lên, hàm lượng kháng nguyên của virus tristeza không đủ để cho phép phát hiện