Conjugate buffer
Albumin huyết thanh bò (Bovine serum albumin – BSA) là protein được sử dụng nhiều trong các kỹ thuật lai phân tử với vai trò là chất blocking. BSA có khả năng liên kết vào giếng ELISA tại những vị trí không có kháng thể bắt giữ. Do đó, ngăn chặn các liên kết không đặc hiệu giữa kháng thể cộng hợp enzyme với bề mặt của giếng ELISA. Ngoài ra, BSA có tác dụng giảm bớt tín hiệu nền, tăng cường các tín hiệu lai đặc hiệu [22], [29]. Vì vậy, để tăng cường tính đặc hiệu của kỹ thuật ELISA phát hiện bệnh tristeza chúng tôi tiến hành thử nghiệm nồng độ BSA được bổ sung vào trong đệm cộng hợp (conjugate buffer). Kết quả được thể hiện trong hình 4.3.
Hình 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lương BSA pha loãng trong đệm Conjugate buffer. TN3: hàm lượng BSA 2,0 g/l; TN4: Hàm lượng BSA 4,0 g/l
Kết quả nghiên cứu so sánh 2 nồng độ BSA khác nhau (2,0 g/l ở TN3 và 4,0 g/l ở TN4) cho thấy: khi đệm cộng hợp được bổ sung BSA với hàm lượng 2,0 g/l (TN3 hình 4.3), không có sự khác biệt về cường độ tín hiệu màu giữa các giếng phân tích mẫu bị bệnh và mẫu không bị bệnh. Điều này chứng tỏ
hàm lượng BSA không đủ để liên kết vào các vị trí trống tại các giếng ELISA dẫn đến kháng thể cộng hợp enzyme đã liên kết không đặc hiệu vào các vị trí này làm cho tín hiệu màu của phản ứng tăng lên.
Khi thử nghiệm với hàm lượng BSA là 4,0 g/l (TN4 hình 4.3) ở các giếng phân tích các mẫu bị bệnh (cột 1) có cường độ tín hiệu màu cao hơn rõ ràng so với cường độ tín hiệu màu của mẫu kiểm chứng âm tính. Các giếng phân tích mẫu không bị bệnh (cột 2), cường độ tín hiệu màu thu được thấp hơn hoặc bằng mẫu kiểm chứng âm tính phù hợp với kết quả kiểu hình.
Kết quả này cho thấy, sử dụng nồng độ BSA 4,0 g/l trong đệm cộng hợp giúp tăng độ đặc hiệu của kỹ thuật ELISA phát hiện tristeza ở cam, quýt. Do đó, trong các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi sử dụng BSA với nồng độ 4,0 g/l.