NH NGăNGHIểNăC UăTH CăNGHI MăHO CăLụăTHU YT- 123docz.net

L IăM ăU

2. NH NGăNGHIểNăC UăTH CăNGHI MăHO CăLụăTHU YT

2.1. M c tiêu nghiên c u:

Quaăvi c đánhăgiáătìnhăhìnhăb nhăgoutătrongăn căvƠăth ăgi iăvƠănh ngă nhă h ngăx uăđ năch tăl ngăs ngămƠăb nhăphơnăph iăđ iăm t,ăm cătiêuăc aălu năv nă nƠyăs ăti năhƠnhăsƠngăl căvƠăđánhăgiáăcácăloƠiăth căv tăcóăkh ăn ngăh ătr ăđi uătr ă goutănh ăho tătínhă căch ăenzymeăxanthineăoxidaseăthôngăquaăthíănghi măin vitro và

sauăđóăt iă uăđi uăki năchi tăv iăm cătiêuălƠăhƠmăl ngăflavonoidăt ngăvƠăho tătínhă căch ăxanthineăoxidaseăc aăth căv tăcóăho tătínhăt tănh t.

B ng 2.1. Các đ i t ng th c v t kh o sát

Tên th c v t Tên khoa h c B ph n s d ng

Mãng c u ta Annona squamosa L. Lá

Ng i c u Artemisia vulgaris L. Thân, lá

Ng ătr o Vitex negundo L. Lá

i bi Blumea balsamifera (L.) DC. Thân, lá

Sen Nelumbo nucifera Gaertn Lá

Actiso Cynara cardunculus L. Lá

Di p h châu Phyllanthus urinaria L. Thân, lá

i Psidium guajava L. Lá

Lá l t Piper lolot C.DC. Thân, lá

D a Pandanus amaryllifolius Roxb. Lá

C i b xanh Brassica juncea L Lá

2.2. N i dung nghiên c u:

T ăm cătiêuăđ ăra,ăn iădungăc aălu năv năbaoăg măhaiăn iădungăchính:

N i dung 1:SƠngăl căho tătínhă căch ăenzymeăxanthineăoxidaseăc aă11ăloƠiăth căv tă g măsen,ăđ iăbi,ăactiso,ădi păh ăchơu,ă i,ăng iăc u,ăng ătr o,ămưngăc uăta,ăláăd a,ăc iă b ăxanhăvƠăláăl tv iăcácăn iădungăth căhi năc ăth ănh ăsau:

- X ălỦăvƠăđánhăgiáăcácălo iănguyênăli u.

28 - nhăl ngăpolyphenol và flavonoidăt ngăc aăcácăcaoăđ ăd ăđoánăho tătínhă sinhăh căc aăchúng.

- Kh oăsátăkh ăn ngă căch ăenzyme xanthine oxidase c aăcácăcaoăđ ătìmăraăloƠiă th căv tăcóăho tătínhăm nhănh t.ă

N i dung 2:T iă uăhóaăquyătrìnhăchi tăc aăth căv tăđ căch năcho ho tătínhă căch ă enzymeăxanthineăoxidaseăvƠăhƠmăl ngăflavonoidăt ng.

- Th căhi năluơnăphiênăt ngăbi n v iăcácăđi uăki năkhácănhauă(n ngăđ ădungă môi,ănhi tăđ ,ăth iăgian,ăt ăl ăr n/l ng)ăđ ătìmăraăđi măt iă uă(đi uăki nătríchălyăthíchă h pămƠăt iăđóăho tătínhă căch ăenzymeăxanthine oxidase lƠăt iă u).

- Th căhi năquyăho chăth cănghi măv iăcácăđi uăki năkhácănhauă(n ngăđ ădungă môi,ănhi tăđ ,ăth iăgian,ăt ăl ăr n/l ng)ăđ ătìmăraăđi măt iă uă(đi uăki nătríchălyăthíchă h pămƠăt iăđóăhƠmăl ngăflavonoid lƠăt iă u).

- Soăsánhăki mătraăgiáătr ăTFCăvƠăkh ăn ngă căch ăenzymeăxanthine oxidase c aă c ă2ăđi măt iă u.

- Xácăđ nhl iăkh ăn ngăkhángăoxy hóa,ăkhángăviêmăvƠăphơnătíchăph ăFT-IR c aă

2 m uăcaoăt iă u.

2.3. Hóa ch t và thi t b :

Hóaă ch t:ăEnzyme xanthine oxidase, xanthine, allopurinol, acid gallic, ethanol, DPPH, enzyme hyaluronidase, BSA, ascorbic acid, ursolic acid, Na2CO3, HCl, NaOH, folinậciocalteau, FeCl3 vƠăcácăhóaăch tăkhácầ

Thi tăb :ămáyăđoăđ ă mă(SATORIUSăMB45),ămáyăcôăquayă(REă301A-W),ăb ăđánhă siêuăơmă(ElmasonicăS100H),ămáyăđoăquangăph ăUV-Vis (Genesys 10S UV ậ Vis),

máyă ăl că(AwarenessăStatăFaxăậ 2200).

2.4. Ph ngăphápănghiênăc u 2.4.1. Xác đ nh đ tro toàn ph n

V iăm uăth ălƠăd căli u,ăchoă2găb tăm uăth ăvƠoăchénăs ăho căchénăplatinăđưă nungănóngăvƠăcơnăbì.ăNungă ănhi tăđ ă450oCăt iăkhiăkhôngăcònăcarbon,ălƠmăngu iăr iă cơn.ăTrongătr ngăh pătroăch aălo iăh tăcarbonăthìădùngăm tăítăn cănóngăchoăvƠoă kh iăch tăđưăthanăhóa,ăkhu yăđ uăb ngăđ aăth yătinh,ăl căquaăgi yăl căkhôngătro,ăthuă

d chăl căvƠoăm tăc căriêng,ăchoăgi yăl căvƠăc năvƠoăchénăvƠănungăđ năkhiăthuăđ că troămƠuătr ngăho căg nănh ătr ng.ăChoăph năd chăl căvƠoăc nătrongăchénănungăvƠăchoă b căh iăđ năkhiăkh iăl ngăkhôngăđ i,ăt ăl ăph nătr măc aătroătoƠnăph năđ cătínhă theoăcôngăth căsau [60]:

� tro m m W

m1, m2:ăkh iăl ngăchénătr căvƠăsauănungă(g) W:ăđ ă măd căli uă(%)

2.4.2. Xác đ nh đ m

Dùngămáyăđoăđ ă mă(SATORIUSăMB45),ăcơnă0.100găd căli u,ărưiăđ uătrênă đ aănhômăvƠăs yă ă105oCăđ năkhiăkh iăl ngăkhôngăđ i.ă ă măd căli uăs ăđ c

hi năth ătrênămƠnăhìnhămáyăkhiăquáătrìnhăđoăk tăthúc.ă ă măđ cătínhătheoăcôngăth că

sau [60]:

W m m m

m1, m2:ăkh iăl ngătr căvƠăsauă(g)

Th căhi năphépăđoă3ăl năvƠăl yăk tăquáătrungăbình.ăCóăth ăxácăđ nhăkh iăl ngă

nguyênăli uăkhôăt ăđ ă măWătheoăcôngăth căsau:

m ô m W

mkhô:ăkh iăl ngănguyênăli uăkhôă(g); m:ăkh iăl ngănguyênăli uăcơnă(g)

2.4.3. Ph ng pháp chi t

Tr căkhiăchi t,ănguyênăli uăđ căđoăđ ă m,ădùngă20.0găb tănguyênăli uăkhôă chi tăv iădungămôiălƠăc nătuy tăđ i,ăt ăl ă1:10ă(g/mL),ăđunătrênăb păcáchăth y,ănhi tă đ ădaoăđ ngăt ă40ăậ 50oCătrongă45ăphút,ădùngăcánhăkhu yăchơnăv tăv iăt căđ ăkhu yă

270 ậ 280ărpm.ăSauăkhiăk tăthúcăquáătrìnhăchi t,ăl căbưăvƠăthuăh iăbưăchoăquáătrìnhă chi tăti pătheo.ăD chăchi tăđ căcôăquayăb ngămáyăcôăquayă(REă301A-W), sau cô

quayăthuăđ căcaoăchi t,ăxácăđ nhăđ ă măcaoăchi tăvƠăchuy năsangăkh iăl ngăcaoă khôăđ ătínhăhi uăsu tăchi tătheoăcôngăth căsau:

H m m ô

ê ô

mcao khô:ă kh iă l ngă caoă khôă thuă đ că sauă côăquay (g); mnguyênă li uă khô:ă kh iă l ngă nguyênăli uăkhôăđemăchi tă(g)

Hình 2.1. Quy trình chi t

2.4.4. Ph ng pháp kh o sát s b thành ph n hóa h c th c v t nhătínhăpolyphenol

Choă2mLăd chăchi tăvƠoă ngănghi m,ăsauăđóăthêmăvƠiăgi tădungăd chăFeCl3.ă TùyăvƠoăs ăl ng,ăv ătríănhómăOHătrongăphơnăt ămƠăchoămƠuăl c,ăxanh,ănơuăđ .

nhătínhăflavonoids

Tácăd ngăv iăMg/HCl:ăthêmăvƠiăh tăMgăkimălo iăvƠoăd chăchi tăr iănh ăt ăt ă HClăđ măđ căvƠo.ăSauăvƠiăphútăs ăcóămƠuăđ ăcam,ăđ ăth măho căđ ăt iă ngăv iăcácă h păch tăflavon,ăflavonol,ăflavanonol,ăflavanone.

Tácăd ngăv iăchìăacetate:ăchoă1mLăd chăchi tăvƠoă ngănghi m,ăsauăđóăthêmă1mLă dungăd chăchìăacetateă10%.ăPh năt oăt aăt ăvƠngăđ năs m.

nhătínhăalkaloid

Dùng kho ngă5ăgăb tăd căli uăvƠădungăd chăH2SO4 1%ăchoăvƠoăerlenăvƠăđună nh ătrongă1ăgi .ăTi năhƠnhăl căvƠăl yăd chăl căth ănghi măv iăcácălo iăthu căth :ă

Mayer, Dragendorff.

nhătínhătannin

ThêmăvƠoăd chăchi tă1mLădungăd chăgelatină1%ăcóăch aă10%ăNaCl.ăHi năt ng

d ngătínhăkhiăcóăph nă ngăt oăt a.

nhătínhăcarotenoid

ChoăvƠoăd chăchi tă2ăgi tăH2SO4 đ măđ c,ădungăd chăxu tăhi năánhăxanhăd ngă n uăcóăm tăcarotenoids.

2.4.5. nh l ng polyphenol t ng

Nguyênăt c:ăD aătrênăph nă ngăgi aăthu căth ăoxyăhóaăkh ăFolin-Ciocalteuă(g mă

acid phosphotungstic (H3PW12O40) và acid phosphomolybdic (H3PMo12O40))ăv iăh pă ch tăphenolicăt oăthƠnhăh năh păoxideăcóămƠuăxanhă(W8O23 và Mo8O23).ăTi năhƠnhă đoăđ ăh păthuăt iăb căsóngă760ănmăvƠăxácăđ nhăhƠmăl ngăpolyphenolăt ngăd aătrênă đ ngăchu năc aăacidăgallic [102].

Ph ngăphápăth căhi n:

Chu năb ăcácădungăd chăsau:ă

Kh iăl ngăc năcơnăchoăm uăcaoăđ cătínhătheoăcôngăth c:

Trongăđó:ă M (g): kh iăl ngăcaoăc năcơn

C (ppm): n ngăđ ăm uăc năpha Vă(ml):ăth ătíchăm uăc năpha hă(%):ăđ ă măc aăm uăcao

Dungăd chăNa2CO3 20%: hòa tan 20 g Na2CO3 b ngăn căc t,ăđ nhăm căthƠnhă100ă mLăvƠăđunăsôi.ăThêmăm tăvƠiătinhăth ăNa2CO3 sauăkhiădungăd chăngu iăvƠăch ăsauă 24hăđ ăl căl yădungăd chătrong.

Dungăd chăacidăgallică1mg/mL:ăhòaătană10ămgăacidăgallicătrongă1ămLăDMSO,ăđ nhă m călên10ămLăb ngăn căc tăvƠăphaăloưngăthƠnhăcácăn ngăđ ăsau:ă1000,ă900,ă800,ă

700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 0 (µg/mL).

ngăchu năacidăgallic:

Choă200ăµLăthu căth ăFolin-CiocalteuăvƠoă40ăµLădungăd chăacidăgallicăt iăcácă n ngăđ ăkhácănhau,ăđ ngănh tăb ngăb ăsiêuăơmătrongă5ăphútă ănhi tăđ ăphòng.ăThêmă 600ăµLădungăd chăNa2CO3 20%ăvƠă3160ăµLăn căc tăvƠăh năh pătrên,ăđ ngănh tăb ngă b ăl căsiêuăơmătrongă30ăphútă ănhi tăđ ăphòng.ăTi năhƠnhăđoăquangăt iăb căsóngă760ă nm.ăL păl iă3ăl năchoăm iăn ngăđ ,ăl yăgiáătr trung bình. Cácăb căti năhƠnhăl pă đ ngăchu năacidăgallicăđ cămôăt ătrongăHình 2.2.

Hình 2.3. ng chu n acid gallic

Tính toán k t qu : t đ h p thu c a acid gallic t i các n ngăđ , d ngăđ căđ th Hình 2.3.

oăm u:ă

Hòaătană10ămgăcaoăchi tătrongă1ămLăDMSOă100%ăvƠăphaăthƠnhăcácăn ngăđ ă phùăh păcóăđ ăh păthuăn mătrongăkho nătuy nătínhăc aăđ ngăchu năacidăgallic.ăTi nă hƠnhăđoăm uăt ngăt ăb căl păđ ngăchu năacidăgallic,ăl păl iă3ăl năvƠăl yăgiáătr ă

trung bình.

HƠmăl ngăpolyphenolăt ngăđ cătínhătheoăcôngăth căsau:

TPC GAE mv

TPC:ăhƠmăl ngăpolyphenolăt ngătrênă1ăgăcaoăchi tă(mg/g)

GAE:ăhƠmăl ngăt ngăđ ngăc aăacidăgallicăsuyăraăt ăđ ngăchu nă(mg/mL) v:ăth ătíchăm uă(mL)

m:ăkh iăl ngăkhôăc aăm uă(g)

2.4.6. nh l ng flavonoids b ng ph n ng t o ph c v i AlCl3

Nguyênăt c:ăd aătrênăph nă ngăt oăph căgi aăAlCl3 v iăflanovoids.ăTi năhƠnhăđoăđ ă h păthu t iăb căsóngă425ănmăvƠăd aăvƠoăđ ăth ăđ ngăchu năquercetinăđ ăxácăđ nhă hƠmăl ngăflavonoidsăt ngă ngă[103].

Chu năb ăcácdungăd chăsau:

Dungăd chăAlCl3 10%: hòa tan 10 g AlCl3 b ngăn căc tăvƠăđ nhăm căđ nă100ămL. Dungăd chăNaNO2 5%: hòa tan 5 g NaNO2 b ngăn căc tăvƠăđ nhăm căđ nă100ămL. Dungăd chăNaOHă1M:ăhòaătană4ăgăNaOHăb ngăn căc tăvƠăđ nhăm căđ n 100 mL.

Dungăd chăquercetin 1000 µg/mL: hòaătană10ămgăquercetinăb ngă1ămLămethanolăvƠă ti năhƠnhăphaăloưngădungăd chătrênăthƠnhăcácăn ngăđ ăsau:ă1000,ă900,ă800,ă700,ă600,ă

500, 400, 300, 200, 100, 0 (µg/mL).

ngăchu năquercetin:

H năh păđ uăg m:ă2ămLăn căc t,ă0.5ămLăquercetin và 0.15 mL NaNO2 5%. Sau 5 phút, cho thêm 0.15 mL AlCl3 10%.ăSauă1ăphút,ăb ăsungăthêmă1ămLăNaOHă1Mă vƠă1.2ămLăn căc t.ăTi năhƠnhăđoăquangăt iăb căsóngă425ănm,ăl păl iă3ăl năvƠăl yă giáătr ătrungăbình,ăt ăđóăd ngăđ ngăchu năquercetin. Cácăb căti năhƠnhăl păđ ngă chu năđ cămôăt ătrongăHình 2.4.

Hình 2.5. ng chu n quercetin

Tính toán k t qu : t đ h p thu c a dung d ch quercetin t i các n ngăđ , d ng

đ căđ th Hình 2.5.

oăm u:

Ti năhƠnhăt ngăt ăb căl păđ ngăchu nănh ngăthayăquercetinăb ngăcaoăchi t,ă l păl iă3ăl năvƠăl yăgiáătr ătrungăbình.ăT ngăhƠmăl ngăflavonoidsăđ căxácăđ nhătheoă côngăth căsau:

TFC QUER mv

TFC:ăt ngăhƠmăl ngăflavonoidsătrênă1ăgăcaoăchi tă(mg/g)

QUER:ăhƠmăl ngăt ngăđ ngăc aăquercetinăsuyăraăt ăđ ngăchu nă(mg/mL) v:ăth ătíchăm uă(mL)

m:ăkh iăl ngăkhôăc aăm uă(g)

2.4.7. Kh o sát ho t tính c ch enzyme xanthine oxidase

Nguyênăt c:ăđánhăgiáăho tătínhă căch ăenzymeăxanthineăoxidaseăd aătrênăkh ăn ngă căch ăquáătrìnhăchuy năhóaăxanthineăthƠnhăacidăuric (Hình 2.6).ăTi năhƠnhăđoăquangă t iăb căsóngă290ănmăvƠăsoăsánhăs ăchênhăl chăgi aăđ ăh păthuăc aăblankăvƠăm uăth ă đ ăxácăđ nhăIC50.

Hình 2.6. Quá trình chuy n hóa xanthine thành acid uric

Ph ngăphápăth căhi n:

Ti năhƠnhăphaăblankăvƠăm uăth ătrênăđ aă48ăgi ng.ăH năh păđ uăg mă250ăµLă m u,ă 175ă µLă đ mă phosphateă (pH ), 150 µL enzyme xanthine oxidase (0.1

units/mL).ă ăt iă trongă15ăphút,ăsauăđóăthêmă300ăµLăxanthineăvƠă ăt iăcùngăđi uă ki nătrongă30ăphút.ăCu iăcùngăthêmă125ăµLăHClă1M,ă ăt iăcùngăđi uăki nătrongă2ă phútăvƠăti năhƠnhăđoăquangăt iăb căsóngă290ănm.ă

iăv iăblank,ăthayă250ăµLăm uăb ngădungămôiăphaăm uă(DMSOă5%).ăCònăđ iă v iăm uătr ămƠu,ăthayă150ăµLăenzymeăxanthineăoxidaseăb ngădungămôiăphaăenzymeă (đ măphosphateăpH ).

Kh ăn ngă căch ăenzymeăxanthineăoxidaseăđ cătínhătheoăcôngăth căsau:

I A A A à

Am u:ăđ ăh păthuăc aăm uăth

Amàu:ăđ ăh păthuăc aăm uătr ămƠuă(khôngăcóăenzyme)

Ablank:ăđ ăh păthuăc aăblankă(khôngăcóăcao)

IC50 lƠăn ngăđ ăm uăchoăkh ăn ngă căch ăenzymeăxanthineăoxidaseă50%,ăgiáătr ăIC50

cƠngănh ăthìăho tătínhăc aăm uăth cƠngăcao.ăV iăthíănghi măin vitro,ăcóăth ăd aăvƠoă

IC50 đ ăđánhăgiáăvƠăsoăsánhăho tătínhăgi aăcácăm uăthíănghi m.ă ăxácăđ nhăIC50,

tr cătiênăph iăv ăđ ăth ăbi udi năs ăph ăthu căc aăph nătr mă căch ăIă(%)ăv iăn ngă đ ăm uăth ,ăd aăvƠoăph ngătrìnhătuy nătínhăcóăd ngăy=ax+bărútăraăt ăđ ăth ătrênă(v iă yălƠăIă(%)ăvƠăxălƠăn ngăđ ăm uăth )ăs ăsuyăraăđ căgiáătr ăIC50.

2.4.8. ánh giá kh n ng kháng oxy hóa b ng DPPH

Nguyênăt c:ă2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylă(DPPH)ălƠăm tăh păch tăh uăc ăt năt iă d iăd ngăg căt ădo,ăcóăđ ăh păthuăm nhăt iăb căsóngă517ănm.ăDPPHăd iăd ngă g căt ădoăcóămƠuătímătrongădungăd chăvƠăs ăchuy năsangăkhôngămƠuăho căvƠngănh tă khiăph nă ngăv iăcácăch tăkhángăoxyăhóa,ăkh ăn ngăb tăg căt ădoăc aăh păch tăkh oă sátăcƠngăm nhăthìăđ ăh păthuăt iăb căsóngă517ănmăc aăDPPHăcƠngăgi m.ăDoăđó,ă thôngăquaăvi căsoăsánhăđ ăh păthuăc aăm uăth ăvƠăm uăblankăcóăth ăđánhăgiáăkh ă n ngăkhángăoxyăhóaăc aăh păch tăkh oăsát.ăTrongăth ănghi mănƠy,ăho tătínhăkhángă oxyăhóaăđ căti năhƠnhătheoăph ngăphápăc aăSharma v iăvitaminăCăđ c dùng làm ch tăđ i chi u [104]. M i thí nghi m ti n hành 3 l n và l y giá tr trung bình.

Hình 2.7. Ph n ng gi a DPPả và ch t kháng oxy hóa

Ph nătr măb tăg căt ădoăDPPHăđ cătínhătheoăcôngăth c:

b t g c t do A AA A

Ab:ăđ ăh păthuăc aăm uătr ng

As:ăđ ăh păthuăc aăm uăkh oăsát

Ac:ăđ ăh păthuăc aăm uătr ămƠu

Ph ngăphápăth căhi n:

Chu năb ăm u:ăcơnăkh iăl ngăcaoăvƠăd aăvƠoăđ ă măđ ătínhăraăkh iăl ngăcaoă

khô. Hòa tan cao b ngădungămôiămethanolă80%ăvƠăphaăloưngăthƠnhănhi uăn ngăđ khácănhau.ăTi năhƠnhăthíănghi mă ăt ngăn ngăđ đ ărƠăsoátăkh ăn ngăkhángăoxyăhóaă vƠătìmăkho ngăn ngăđ ăch aăgiáătr ăIC50.

Quyătrìnhăth ăho tătính:ăhòaătanăDPPHătrongămethanolă80%ăsaoăchoăđ ăh păthuă t iăb căsóngă517ănmăc aădungăd chălƠă0.7ă±ă0.2.ăM uăcaoăchi tăđ căphaătrongă

đ căl căđ u,ăđ ătrongăbóngăt iă ănhi tăđ ăphòngăv iăth iăgianălƠă30ăphút,ăđoăđ ăh pă thuă ăb căsóngă517 nm.ăTi năhƠnhăt ngăt ăv iăm uătr ngăvƠăch ngăd ngănh ngă thayăcaoăchi tăb ngădungămôiăphaăcaoă(methanol 80%)ăđ i v i m u tr ng.ă i v i m uăđ i ch ng, thay cao chi t b ng 120 µL vitamin C (hòa tan trong methanol 80%).

Hình 2.8. Quy trình đánh giá kh n ng kháng oxy hóa

2.4.9. Kh o sát ho t tính kháng viêm theo c ch Hyaluronic acid (HA) Nguyênăt că

Hyaluronicăacidă(HA)ălƠăphơnăt ăcóăkh iăl ngăl n,ăphơnăc c,ăcóătrongăch tăn nă ngo iăbƠoăc aăh uăh tăđ ngăv t.ăHAălƠăphơnăt ă aăn cădoăc uătrúcăphơnăt ătíchăđi nă ơm.ăHAăcóăc uătrúcălƠăcácăpolysaccharide,ăho tăđ ngănh ăm tăch tăkeoăđ ăgi ăcácă proteinăvƠăcácămonomeăc aăaggrecanăthôngăquaăc uătrúcăm chădƠiăc aăHA, đ ngăth iă h ătr ăcácăquáătrìnhăc ăh căc ngănh ăkh ăn ngăt ngăgi măth ătíchăc aăch tăn năngo iă

Hình 2.9. C u trúc phân t ảyaluronic acid

Vi căng năch năs ăphơnătáchăHAăthƠnhăcácăđo nănh ăcóăvaiătròăquanătr ngătrongă quáătrìnhăng năkhôngăchoăquáătrìnhăgơyăviêmăx yăra.Tuyănhiên,ătrongăch tăn năngo iă bƠo,ă HAă th ngă đ că phơnă c tă b iă cácă yêuă t ă nh ă g că t ă doă ROS,ă hayă enzymeă hyaluronidaseă(ăHAases)ăthƠnhăcácăđo nănh ăh năđ ăt oănênăph nă ngăviêmăc aăc ă th ăv iăcácăbi uăhi nănóng,ăđ ,ăs ng,ăđauăkhiăc ăth ăch uăcácăt năth ng,ăcácăph nă ngăgơyăd ă ngăc ngănh ăt ngătínhăth măc aăm chămáuăb ngăcáchălƠmăgi măđ ănh tă c aăHA.ă ngăth i,ăHAasesăc ngăđ căbi tăđ nănh ălƠăm tăenzymeăliênăquanăđ nă quáătrìnhătáiăt oămôătrongăquáătrìnhăviêmănhi m [106, 107].ăVìăv y,ăđ ăđ tăđ căkh ă n ngă khángă viêmă t t,ă c nă ph iă că ch ă đ că enzymeă HAasesă đ ă ng nă khôngă choă enzymeănƠyăphơnăc tăHAăthƠnhăcácăđo năcóăkh iăl ngăphơnăt ănh ăgơyăviêm .

ăng năch năquáătrìnhăviêmădi năra,ăc năph iăh năch ăs ăcóăm tăc aăcácăLHAă b ngăcáchă cch ăho tăđ ngăc aăenzymeăHAasesăđ ăng năc năkh ăn ngăphơnăc tăHAă thƠnhăcácăđo nănh .ăBSAă(bonvineăserumăalbumine)ălƠălo iăproteinăhuy tăthanhăbòă choăph nă ngăt oăt aăkhiătácăd ngăv iăHHAătrongămôiătr ngăthíchăh p,ăđ ngăth iăcóă kh ă n ngă liênă k tă v iă cácă thu că khángă viêmă khôngă steroidă (Nonsteroidală anti- imflammation drugs ậ NSAIDS).ăNh ngăn uăHAasesăphơnăc tăHAăthƠnhăcácăđo nă nh ăh năthìăph nă ngăt oăt aăv iăBSAăs ăkhôngăx yăra.ăDoăđó,ăBSAălƠăch tăđ căs ă d ngăđ ănh năbi tăs ăcóăm tăc aăHHAăhayăLHA [108].ăPh ngăphápăkh oăsátăkh ă

n ngă căch ăenzymeăHAasesăthôngăquaăph nă ngăt oăt aăc aăBSAăv iăHHAăvƠăLHAă lƠăph ngăphápăm i,ăhi năđ iăvƠăchínhăxácăcaoăvìăcácăhóaăch tăđ uăt ngăđ ngăv iă quáătrìnhăviêmătrênăc ăth ăng i.ăPh ngăphápăđ căth căhi năd aătrênăph ngăphápă mƠăYusăAzilaăYahayaăvƠăc ngăs ăđưăđ ăxu t [109].

Ph nătr măl ngă căch ăs ăbi nătínhăđ cătínhătheoăcôngăth c: % Iă c ch ăă=ă ăD -ăC

B A ăỪă100

Trongăđó:ă

A:ăđ ăh păthuăc aăm uătr ngăkhiăcóăenzyme

B:ăđ ăh păthuăc aăm uătr ngăkhiăkhôngăcóăenzyme C:ăđ ăh păthuăc aăm uăkhiăcóăenzyme

D:ăđ ăh păthuăc aăm uăkhiăkhôngăcóăenzyme

Ph ngăphápăti năhƠnhă

- Chu năb :ăenzymeăhyaluronidaseă4U/mL,ăc ăch tăhyaluronicăacidă(0,03%ătrongă 300mMănatriăphosphateăv ipHă5,4),ăBSAă0,1%ăphaătrongăđ măpHă3,8ă(24ămMănatriă acetateăvƠă79mMăacidăacetic),ăđ mănatriăphosphateăpHă7ă(200ămM,ă77ămMăNaClăvƠă 0,01%ăBSA),ăm uăkh oăsátăphaătrongăDMSOă5%.

- oăm u:ăh năh păg mă25ăµLăm uăkh oăsát,ă100ăµLăenzymeăHyaluronidaseă,ă 100ăµLăđ măpHă7,ăđemăđiă ăl că ănhi tăđ ă37oCătrongă10ăphút.ăH năh pătrênăsauăđóă đ căthêmăvƠoă100ăµLăc ăch tăhyaluronicăacidă0,03%ăvƠăti păt căđ că ăl că ă37oC

trongă45ăphút.ăSauăđóăthêmăti pă1ămLădungăd chăBSAă0,1%ăvƠăđ ăh năh păraăngoƠiă đi uăki nămôiătr ngătrong 10ăphút.ăSongăsongăđó,ăth căhi năthaoătácăt ngăt ăv iă m uătr ngăcóăvƠăkhôngăcóăenzymeăHyaluronidase,ătrongăđóă25ăµLăm uăkh oăsátăthayă b ngă25ăµLăDMSOă5%.ăTi năhƠnhăđoăđ ăh păthuă ăb căsóngă600ănmăđ ăxácăđ nhă ph nătr mă căch ăenzymeăHyaluronidaseătheoăt ngăn ngăđ ăc aăm uăc năkh oăsát.ă

Ch tăđ cădùngălƠmăch tăđ iăchi uălƠăursolicăacid.ăTh căhi năquyătrìnhănh ă trênăv iăm uăkh oăsátăthayăb ngăch tăđ iăchi uă(ch ngăd ng)ăv iăn ngăđ ăkh oăsátă lƠă12,5;ă25;ă50;ă100;ă200ăµg/mLăđ ătìmăđ căgiáătr ăIC50.

Hình 2.10. Quy trình kh o sát ho t tính c ch enzyme ảyaluronidase

2.4.9. Phân tích quang ph h ng ngo i bi n đ i ạourier (ạTIR)

K ăthu tănƠyăd aătrênănguyênălỦ:ăcácăh păch tăhóaăh căcóăkh ăn ngăh păth ch nă

l căb căx ăh ngăngo i.ăSauăkhiăh păth ăcácăb căx ăh ngăngo i,ăcácăphơnăt ăc a các

h păch tăhóaăh cădaoăđ ngăv iănhi uv năt căkhácănhauăvƠăxu tăhi nd iăph ăh pth ă

vƠăg iălƠăph ăh păth ăb căx ăh ngăngo i.ăCácăđámăph ăkhácănhauăcóăm tătrong ph ă

h ngăngo iăt ngă ngăv iăcácănhómăch căđ cătr ngăvƠăcácăliênăk ttrongăphơnăt h pă

ch tăhóaăh c.

Thi tăb ăquangăph ăbi năđ iăh ngăngo iăFourierăs ăd ngăb ăgiaoăthoaă(giaoăthoa

k ) Michelson. Giao thoa k là thi tb ătáchăchùmăb căx ăthƠnhăhaiăph năcóăc ngăđ

b ng nhau, sauăđóăk t h păl iăthƠnhăb căx ăcóăc ngăđ ăthayăđ iătheoăth iăgian.ăS thayăđ iănƠyălƠădoăquưngăđ ngăđiăc aăhaiăb căx ăb ătáchăraăkhôngăgi ngănhau.ăGiao

thoa k g măm tăg ngăc ăđ nhăvƠăm tăg ngădiăđ ngă(cóăth ădiăchuy năt nhăti n trên

m tăđ ngăth ngăn m ngang).ăHaiăchùmăb căx ăsauăkhiăđ cătách,ăm tăchùmăđiăv

g ngăc ăđ nh,ăchùmăcònăl iăđiăđ năg ngădiăđ ngăvƠăđ căhaiăg ngăph năx ătr ăl i. năđơy,ăchúngăl iăđ cătáchălƠmăhai,ăm tăn aăđiăđ năngu n,ăn aăcònăl iăđiăquaăm u c năđoăv ădetector.ăNh ăv y,ăchùmăb căx ăquaăm uăg măhaiăb căx ăcóăc ngăđ ăkhác

nhau,ăvƠăthayăđ iătheoăth iăgian.ăDetectorăs ăghiănh năs ăbi năđ iăc ngăđ ăb căx ă

r iă chuy nă thƠnhă tínă hi uă đi n. Tín hi uă đi nă đ că máyă tínhă dùngă phépă bi nă đ iă

Fourier chuy năthƠnhăhƠmăc aăc ngăđ ăb căx ătheoăs ăsóng.ăTrongălu năv nănƠy,ă

phépăđoăFTIRăđ căth căhi năt iăVi năKhoaăH căV tăLi uă ngăD ng

Cácăm uăr nă(10ămg)ăđ cătr năv iă100ămgăkaliăbromuaăkhôă(KBR)ăvƠănénăl iă

chu năb ănh ăm tăđ aămu i.ăPhơnătíchăcácăt năs ăc aăcácăthƠnhăph năkhác nhau trong

m iăm u.

2.4.10. Ph ng pháp t i u hóa b ng b m t đáp ng (RSM)

2.4.10.1. Xácăđ nhătơmăvƠăvùngăth cănghi mă

Ho tăch tă căch ăenzymeăxanthineăoxidaseătrongăh ătr ăđi uătr ăb nhăgoutăph ă thu căvƠoăcácăh păch tăt ănhiênăcóătrongăláă iăch aănhi uăho tătínhăsinhăh cănh ă polyphenols,ăflavonoids,ăalkaloids,ăsaponin,....ă ăcóăth ăl yăđ căcácăh păch tăraă kh iăláă i,ăcácăthíănghi măs ăd ngăcácăph ngăphápătríchălyăv iăs ă nhăh ngăc aăcácă y uăt ănh ăn ngăđ ădungămôi,ăth iăgian,ănhi tăđ ,ăt ăl ăr năậl ng.ăCácăđi uăki nătríchă lyăkhácănhauăs ă nhăh ngăđ năkh ăn ngăchi tăcácăh păch tăcóăho tătínhăsinhăh căraă kh iăláă i.ăDo đó,ăđ ăt iă uăho tătínhă căch ăenzymeăxanthineăoxidaseăthìăc năthi tă ph iăcóăm tăđi uăki nătríchălyăthíchăh p.ăPh ngăphápăb ăm tăđápă ngă(RSM)ăđ că ch năđ ăth căhi năquáătrìnhăt iă uăhóaăho tătínhă căch ăenzymeăxanthineăoxidaseăđ ă tìmăraăm iăquanăh ăgi a cácăthôngăs ăvƠăhƠmăm cătiêu.ăKhiăcóăph ngătrìnhămôăt ă chúngăs ăchoăth yăs ă nhăh ngăc aăt ngăthôngăs ăvƠăs ăt ngătácăgi aăcácăthôngăs ă v iănhau,ăt ăđóăd ăđoánăđ căđi măt iă uăc aămôăhình.ă

Các thông s ăkh oăsátăbaoăg măn ngăđ ăc năX1,ănhi tăđ ăchi tăX2,ăt ăl ăr nă-

l ngăX3,ăth iăgianăchi t X4.ăTrongăđóăs ăcóăm tăbi năthayăđ i,ăcácăbi năcònăl iăgi ăc ă đ nh.

2.4.10.2. Quyăho chăth cănghi m

Sauăkhiăxácăđ nhăđ cătơmăthíănghi m,ăti năhƠnhăth căhi năcácăb căđ ăquyă ho chăth cănghi m.ăNghiênăc uănƠyăs ăd ngăph ngăphápăđápă ngăb ăm tă(RSM)ă d aătrênămôăhìnhătơmăxoayăCCDăv iăkă=ă4ăy uăt ă(n ngăđ ădungămôiăchi tăA,ănhi tă đ ăchi tăB,ăt ăl ăr n-l ngăC,ăth iăgianăchi tăD),ăno =ă12ăthíănghi mă ătơm.ăT ăđó,ămôă hìnhăquyăho chăth cănghi măđ căb ătríăg mă3ălo i:

Lo iă1ă(ph năc s ):ăg măn1 = 2k = 24=ă16ăthíănghi mămưăhóaăcácăy uăt ăvƠăs păx pă saoăchoătácăđ ngăc aăcácăy uăt ăkhôngăb ătr năl nănhauăvƠăkhôngăcóăthíănghi măb ă trùng.ăCácăgiáătr ăt iăđơyăđ cămưăhóaăb ngă1ăvƠă-1.

Lo iă2ă(ph nătơm):ăg măno=ă12ăthíănghi măđ căth căhi năl păl iăt ngăt ănhau.ăT iă đơyăcácăgiáătr ăđ cămưăhóaăb ngă0.

Lo iă3:ăg mănk =ă2kă=ă8ăthíănghi măđ căb ătríătrênăcácătr căto ăđ ,ăcáchăg căt aăđ ă m tă đo nă ă >ă 0ă saoă choă maă taă tr nă Xă đ că b ă tríă tr că giao,ă t că lƠă l yă± .ă V iă

= = 2

Nh ăv y,ăgiáătr ăcánhătayăđònă ă=ă± 2ăvƠăs ăthíănghi măc aăph ngăánăc uătrúcăcóătơmă c păhaiă4ăy uăt ălƠăNă=ăno + n1 + nk =ă36ă(thíănghi m)ă[103, 110, 111].

Ph năm măDesignăExpertă11ăđ căs ăd ngăđ ăthi tăk ăvƠăx ălỦăs ăli uăth cănghi mă v iă4ăthôngăs ă nhăh ngăbaoăg măn ngăđ ăc năAă(%),ănhi tăđ ăBă(oC),ăt ăl ăr n/l ngă Că(g/mL)ăvƠăth iăgianăchi tăDă(phút)ăv iăhƠmăm cătiêuălƠăhƠmăl ngăflavonoidsăt ngă

(YTFC)ăvƠăkh ăn ngă căch ăenzymeăXOă(YXOI).

2.4.10.3. ánhăgiáăk tăqu ăthuăđ că

Phân tích s t ngquan gi a mô hình và th c nghi m, phân tích ph ng sai ANOVA

B ng 2.2. ánh giá m i t ng quan gi a mô hình và th c nghi m

R2 < 0,1 T ngăquană m c th p