2.2.1. Hóa chất và nguyên liệu
- Sữa tươi Ba Vì - KNaC4H4O4 - Phenolphtalein - Petroleum ether - NH4OH - FeSO4.7H20 - Dimethyl glyoxime - Diethylether 2.2.2. Môi trƣờng
Môi trường MRS broth: -Peptone 10g -Yeast extract 5g -Meat extract 10g -Glucoza 20g -Tween 80 1g -KH2PO4 2g -Sodium acetate 5g -MgSO4.7H2O 0,2g -MnSO4 0,05g -H2O 1000ml -Agar 20g pH=6-6,5
Môi trường chọn lọc MRS broth bổ sung vancomycin (Levata-Jovanovic and Sandine, 1997):
-Môi trường MRS broth
36
2.2.3. Thiết bị
- Kính hiển vi Olympus – Nhật - Tủ cấy an toàn sinh học - Singapor - Thiết bị ly tâm sữa Falia - Đức
- Thiết bị đồng hóa phòng thí nghiệm – Mỹ
- Máy đo quang phổ UV-VIS Spectrometer - Pháp - Tủ nuôi GYROMAX TM 737 – Mỹ
- Hệ thống cô quay chân không IKA – Đức - Hệ thống chưng cất – Nhật
- Bể ổn nhiệt Memmert – Đức
- Máy li tâm hettich mikro 220r (đức) - Tủ lạnh bảo quản Daewoo – Hàn quốc - Máy do pH Metter Toledo – Đức
37
2.3. Phƣơng pháp phân tích
Các phương pháp phân tích được tiến hành tại phòng Công nghệ enzyme và protein- Viện Công nghiệp thực phẩm.
2.3.1 Phương pháp đếm vi sinh vật tổng số
Nguyên tắc: Sử dụng môi trường MRS agar nuôi cấy đếm vi sinh vật tổng số,
môi trường MRS agar bổ sung Vancomycin sử dụng khi đếm Leuconostoc mesenteroides.
Sau một thời gian nuôi cấy, đếm số khuẩn lạc của vi khuẩn mọc trên bề mặt thạch tương ứng với một đơn vị thể tích dung dịch.
Thực hiện: Môi trường agar được thanh trùng ở 121oC trong 20 phút, tiếp đó rót
ra các đĩa petri đã thanh trùng, khi thạch đông thì lấy mẫu váng sữa lên men cần phân tích. Hòa tan các mẫu váng sữa lên men cần phân tích vào 100 ml dung dịch nước cất với hàm lượng 0,1g/l. Sau đó đem pha loãng đến 10-6, dùng pipec hút 0,1ml dịch pha loãng này cấy lên đĩa thạch chứa môi trường MRS. Các thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Nuôi cấy giống ở các điều kiện thích hợp cho mỗi yêu cầu cần thực hiện. Sau 2 ngày các mẫu được lấy ra và đếm số khuẩn lạc trên mỗi đĩa.
Mật độ tế bào được tính theo công thức sau: X= ( Số khuẩn lạc đếm được × 106) : 0,1 Trong đó:
X: mật độ tế bào vi khuẩn trong dung dịch chưa pha loãng (cfu/ml) 106 : hệ số pha loãng
0,1: số ml dung dịch pha loãng cấy trên môi trường thạch
2.3.2. Phương pháp phân tích diacetyl
Phương pháp được ứng dụng phân tích diacetyl trong sữa. (Pack, Sandine et al., 1964)
2
38 d
Chuẩn bị hóa chất
- Dikali hydrogen photphat trong axeton 14,4g K2HPO4 (19,9g
K2HPO4.3H2O) và 20ml axeton định mức đến 100ml nước cất (a).
- NH4OH (b)
- Muối Kali tartrate 180g KNaC4H4O6 trong 100ml nước cất
(c).
- Sắt sunfat 5g FeSO4.7H20 trong 100ml H2SO4 1% bảo quản lạnh (d).
- Dimethylglyoxime 0,0674 mg/ml: hòa tan 0,1348g Dimethyl
glyoxime hoàn toàn trong 3-5ml cồn, định mức bằng 2 lít nước cất.
- 1 g KH2PO4 0,3M trong 25ml NaOH 0,1M
- Hydroxylamine Hydrochloride NH2OH.HCl 6%
- -
- 20ml
- 00ml
Dựng đƣờng chuẩn
- Cho vào mỗi bình tam giác 50ml: 0,75ml NH2OH.HCl 6%. Bổ sung nước cất tới gần 15ml, giữ ở nhiệt độ 80oC trong 15 phút
- Cho vào mỗi bình 1 ml dung dịch (a) để yên 5 phút; - Thêm 0,6 ml (b);
- 2,5ml dung dịch (c); - 0,2 ml dung dịch (d);
- Định mức đến 25ml bằng nước cất, đo ở bước sóng λ=520nm. -
39 - - - 2PO4 ,75 ml NH2OH.HCl 6% - - 30ml. - oC tro 15ml - 5 (a) - (b) - . (c) - g 0. (d) - 5
40
2.3.3. Phương pháp phân tích độ axit
Nguyên tắc : Dùng NaOH 0,1N để trung hòa các axit tự do có trong sữa với chất chỉ
thị là phenolphtalein
Phương pháp được tiêu chuẩn hóa theo TCVN 5860:1994
2.3.4
Roese-Gottlieb
Nguyên tắc: Ở trong môi trường ammoniac và cồn. Mẫu được chiết bằng diethyl
ether và Petroleum ether, loại bỏ dung môi bằng cô quay chân không hoặc cho bay hơi. Cân phần chất béo còn lại và tính theo hàm lượng.
Chuẩn bị:
-Mẫu phân tích
-Diethyl ether , petroleum ether -NH3, Etanol
-2 Ống facol 50ml
-Thiết bị cô quay chân không ( IKA) -Pipet đầu côn.
Tiến hành
-Cân 5g mẫu váng sữa cho vào ống facol.
-Thêm 5ml etanol + 1ml NH3, đậy nắp, lắc đều hỗn hợp trong 1 phút
-Thêm 12,5ml Diethyl ether + 12,5 ml Petroleum ether, đóng nắp, lắc đều đến khi tách lớp.
-Chiết phần dung dịch lớp ở trên, cho vào bình cầu thiết bị cô quay (Cân khối lượng bình cầu)
-Làm lại từ bước thứ 3 thêm 2 lần.
-Chạy cô quay chân không phần dung dịch được chiết ra.
-Đặt bình cầu sau cô quay sấy đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 110o
C trong 30 – 45 phút.
41 Công thức tính
*100 (%) W- Trọng lượng mẫu phân tích
W2: Trọng lượng bình cầu sau sấy dung dịch đến khối lượng không đổi W1: Trọng lượng bình cầu ban đầu
2.3.5. Phương pháp phân tích độ tách dịch lỏng
Phương pháp đã được Hawarker mô tả cho các sản phẩm sữa lên men (Harwalkar and Kalab, 1983)
Nguyên tắc: Sử dụng lực ly tâm để tách phần dịch lỏng tự do ra khỏi hỗn hợp dạng
gel Chuẩn bị: - Cân, thìa - 2 Ống facol 50 ml - Máy ly tâm Tiến hành
-Cân 10g mẫu vào ống facol.
-Cân một lượng nước cất tương ứng vào ống facol đối trọng. -Ly tâm 3000 rpm, 5 phút, 5oC.
42
2.4. Phƣơng pháp công nghệ
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới quy trình lên men sau:
Hình 2.2. Quy trình sản xuất váng sữa lên men (P. Công nghệ Enzyme và protein- Viện Công nghiệp Thực Phẩm)
Ly tâm 8000 Rpm/phút
Làm nguội Sữa tươi
Thu váng sữa
Chuẩn hóa hàm lượngbéo
Thanh trùng váng sữa
Đồng hóa tại 63 oC
Làm nguội về nhiệt độ thường Chiết rót ra hộp
Lên men trong hộp Cấp giống Làm lạnh về 4oC 40 oC 24h Dừng lên men Váng sữa thành phẩm Phối trộn, bảo quản
43
2.4.1. Sản xuất nguyên liệu
Sữa nguyên liệu với thành phần : chất khô 12,3%, Protein 2,4%, Đường 4,7%, hàm lượng béo 4,0%, thành phần chất khô khác 0,2%. Sử dụng thiết bị ly tâm tách béo sữa tại viện CNTP.
Hình 2.3. West Falia-Đức (FIRI)
Sau khi tách được váng sữa từ thiết bị ly tâm, tiến hành chuẩn bị các nguyên liệu có hàm lượng béo khác nhau bằng phương pháp pha loãng nguyên liệu có hàm lượng béo cao.
Sử dụng phương pháp đường chéo để tính toán tỉ lệ pha. m1 C1 |C2-C|
C m2 C2 |C1-C|
44
Với: m1: khối lượng váng sữa có nồng độ béo cao m2: khối lượng sữa tươi pha loãng
Sau khi chuẩn hóa, đưa nguyên liệu vào thiết bị đồng hóa sữa VELP. Sản phẩm tạo thành chính là váng sữa nguyên liệu cho quá trình lên men.
2.4.2. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men váng sữa
Khảo sát ảnh hưởng của citrat.
Sau khi khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chất béo chúng tôi chọn cố định một hàm lượng tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của citrat.
Cô định các thông số: hàm lượng béo, nhiệt độ, thời gian. Thay đổi hàm lượng citrat: mẫu bổ sung 0,05% citrat, mẫu bổ sung 0,1% citrat và mẫu nguyên liệu không bổ sung
Tiến hành đo các chỉ tiêu sau lên men tại các thời điểm khác nhau: độ acid, độ tách dịch lỏng, hàm lượng diacetyl
Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ giống bằng cách cố định các thông số: nồng độ béo, nhiệt độ, thời gian. Tỉ lệ giống thay đổi từ 0,01% - 0,05%
Tiến hành đo các chỉ tiêu sau lên men: độ acid, độ tách dịch lỏng, hàm lượng diacetyl
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ bằng cách cố định các thông số: nồng độ béo, thời gian, tỉ lệ giống. Nhiệt độ thay đổi: 20, 22, 24, 26, 28, 30 oC
Tiến hành đo các chỉ tiêu sau lên men tại các thời điểm khác nhau: độ acid, độ tách dịch lỏng, hàm lượng diacetyl
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men bằng cách cố định các thông số: nồng độ béo, nhiệt độ, tỉ lệ giống. Thời gian lên men: 8h,10h,12h,14h,16h
45
Tiến hành đo các chỉ tiêu sau lên men tại các thời điểm khác nhau: độ acid, độ tách dịch lỏng, hàm lượng diacetyl
2.4.3. Phương pháp đánh giá chất lượng sản phẩm
Sau khi lên men tiến hành làm lạnh 2oC-5oC trong 24h, còn gọi là quá trình ủ chín. Nếu để sản phẩm tiếp xúc với nhiệt độ cao hoặc bảo quản quá 4 tuần dẫn đến việc tách whey. Cần tránh lắc, khuấy sản phẩm bởi điều này có thể làm giảm hương vị. (Rieder, 2007). Quá trình ủ lạnh ngay sau khi dừng lên men nhằm ức chế sự hoạt động của enzyme reductase diacetyl từ đó ngăn ngừa được sự giảm hương vị sản phẩm. Từ đó quá trình này giúp diacetyl trong sản phẩm váng sữa lên men được ổn định và cải thiện (Pack, Vedamuthu et al., 1968).
Phân tích các chỉ tiêu chất lượng của váng sữa lên men như: độ axit, độ tách dịch lỏng, hàm lượng diacetyl, mật độ vi sinh vật để đánh giá sản phẩm sau quá trình ủ chín. Đánh giá chỉ tiêu mật độ vi sinh vật bằng phương pháp cấy đếm khuẩn lạc trên môi trường MRS broth.
Một sản phẩm váng sữa lên men được coi là sản phẩm tốt với các yêu cầu sau: -Chỉ tiêu cảm quan màu sắc tươi sáng, đồng nhất cao, độ mịn cao, hương thơm đặc trưng.
-Độ axit đạt mức 65~73oT sản phẩm đạt chất lượng tốt (Sapurina, Nekrasova et al., 1981). Nếu độ axit quá cao dẫn đến sản phẩm bị chua ảnh hưởng tới cấu trúc.
-Độ tách dịch lỏng ở mức thấp hơn 35% (Harwalkar and Kalab, 1983;Lucey and Singh, 1997)
46
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ
3.1. Đánh giá chất lƣợng váng sữa nguyên liệu
3.1.1. Chất lượng sữa tươi nguyên liệu
Xác định hàm lượng chất khô bằng phương pháp sấy ở 110 oC, xác định hàm lượng chất béo bằng phương pháp Roese-Gottlieb. Qua đó ta được bảng kết quả:
Bảng 3.1. Thành phần chất khô trong sữa nguyên liệu
Chỉ tiêu Thành phần trong sữa nguyên liệu
Chất khô 12,3% Protein* 3,4 % Đƣờng ** 4,7 % Chất béo 4,0 % Vật chất khác 0,2% Độ axit 17,1 oT
* xác định hàm lượng protein theo phương pháp Branford ** xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Bertrand
*;** Kết quả cung cấp bởi bộ môn “ Công nghệ Protein và Enzyme” -Viện Công nghiệp thực phẩm
3.1.2. Chất lượng váng sữa nguyên liệu
Sữ ợc 3o
Sản phẩm váng sữa thu được phân tích đánh giá như bảng 3.2. Bảng 3.2. Một số chỉ tiêu đánh giá váng sữa nguyên liệu
Chỉ tiêu Mô tả
trắng sữa
Kết cấu ở nhiệt độ thường;
ở nhiệt độ 40oC Thơm nhẹ kem, bơ
40%
47
Váng sữa sau khi được chuẩn hóa các nồng độ khác nhau, đồng hóa bởi thiết bị đồng hóa quy mô phòng thí nghiệm, sau đó được khẳng định lại bằng phân tích hàm lượng béo bởi phương pháp Roese-Gottlieb. Kết quả như bảng sau:
Bảng 3.3. Thành phần váng sữa nguyên liệu
Loại nguyên liệu Váng sữa 10% béo Váng sữa 20% béo Váng sữa 30% béo Váng sữa 40% béo Chất khô (%) 17,7 26,9 36 45,9 Protein (%) 3,1 2,77 2,42 2,18 Đƣờng (%) 4,39 3,9 3,41 3,1 Citrat (%) 0,16 0,14 0,12 0,10 Độ axit (oT) 17 16,8 16,6 16,5
Váng sữa nguyên liệu trước khi lên men có thể bổ sung sữa bột không béo, một số chất ổn định, muối citrat hoặc acid citric. Từ đó giúp váng sữa lên men có cấu trúc bền vững ổn định hơn, hương đậm hơn, thời gian lên men giảm đi đáng kể (US- Patent, 1955;Rieder, 2007;Born, 2013).
3.1.3. Biến đổi trong lên men váng sữa có hàm lượng béo khác nhau
váng sữa váng
sữa ới các nồng độ
men. Theo các nghiên cứu, váng sữa thường được ứng dụng lên men có hàm lượng béo <40% (Rieder, 2007;Tamime, 2008). Chúng tôi tiến hành khảo sát trong dải hàm lượng béo như trên với các điểm mục tiêu: 4%, 10%, 20%, 30%, 40%.
với tỉ lệ 0,03%, nhiệt độ 24oC. Khi lên men tới thời điểm 8h, cảm quan các mẫu đã có sự đông tụ khi nghiêng vẫn còn độ sánh, màu vàng nhạt, thơm mùi bơ đặc trưng. Chúng tôi tiến hành phân tích một số chỉ tiêu tức thời: hàm lượng diacetyl, độ tách dịch lỏng, độ pH. Sau đó chúng tôi tiếp tục lên men sản phẩm tới thời điểm 12h. Tiến hành phân tích các chỉ tiêu tương tự.
Cảm quan các mẫu sau khi lên men 12h, nhận thấy cấu trúc sản phẩm đã đặc hơn thời điểm 8h, màu vàng nhạt, hàm lượng béo tăng dần thì sản phẩm càng đặc.
48
Điều này có thể lý giải bởi hàm lượng béo càng tăng cao thì hàm lượng chất khô càng tăng, với nguyên liệu 4% hàm lượng chất khô chỉ đạt 12,7%, nguyên liệu 30% hàm lượng chất khô tăng lên đến 36%.
Ảnh hưởng của chất béo đến sự phát triển của vi sinh vật được thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Biến đổi mật độ VSV ở váng sữa có hàm lượng béo khác nhau (Thanh sai số biểu thị độ lệch chuẩn – standard deviation)
Khi hàm lượng chất béo tăng lên dẫn đến hàm lượng chất khô tăng lên từ đó làm tăng áp suất thẩm thấu, đồng thời các chất dinh dưỡng thay đổi như protein giảm, lượng đường giảm làm ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Bên cạnh đó hàm lượng chất béo cao còn làm cản trở quá trình trao đổi chất do các cầu béo bao vây tế bào vi sinh vật từ đó dẫn đến ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Từ hình 3.1 ta nhận thấy mật độ vi sinh vật sau 12h lên men có sự khác biệt rõ rệt giữa các váng sữa có hàm lượng béo khác nhau, với sữa tươi có hàm lượng béo 4% mật độ VSV cao nhất đạt 4.108
CFU/ml, hàm lượng béo tăng lên đến 40% thì mật độ vi sinh vật giảm về 0,8.108 CFU/ml. Sự thay đổi về mật độ tế bào sẽ ảnh hưởng tới các chỉ tiêu khác của sản phẩm như: pH, độ axit, khả năng sinh tổng hợp diacetyl và các hợp chất tạo hương khác.
4,0 3,4 2,7 1,5 0,8 0 1 1 2 2 3 3 4 4 5 4% 10% 20% 30% 40% Mật độ,10 8 (cfu/m l) Hàm lƣợng chất béo 12h
49
Hình 3.2. Biến đổi độ axit ở váng sữa có hàm lượng chất béo khác nhau Từ hình 3.2 ta thấy có sự khác biệt giữa độ axit của váng sữa có hàm lượng béo khác nhau, tuy nhiên độ chênh lệch là không nhiều. Có sự biến đổi tỉ lệ giữa hàm lượng béo và độ axit. Hàm lượng béo càng tăng thì pH sau lên men càng giảm, từ 74,9 oT về còn 68,9oT. Điều này giải thích bởi khi tăng hàm lượng chất béo thì đồng thời hàm lượng các chất khô khác trong váng sữa giảm, trong đó có đường lactoza. Lượng axit sinh ra bởi vi sinh vật lên men đường lactoza giảm dần dẫn đến độ axit cũng giảm dần.
Hình 3.3. Biến đổi độ tách dịch lỏng ở váng sữa có hàm lượng béo khác nhau Độ tách dịch lỏng cũng có sự khác biệt với các váng sữa có hàm lượng béo khác nhau, tuy nhiên sự khác biệt không đáng kể. Độ tách dịch lỏng tăng dần khi hàm lượng béo tăng dần. Điều này có thể giải thích bởi 2 yếu tố ảnh hưởng chính đến độ
67,4 66,5 65,7 64,1 62,1 74,9 73,6 72,1 70,1 68,9 0 10 20 30 40 50 60 70 80 4% 10% 20% 30% 40% Độ ax it ( o T) Hàm lƣợng chất béo 8h