L với nồng độ ion Hg(II) Theo đó, cường độ huỳnh quang dung dịc h giảm mạnh
F là cường độ huỳnh quang của phối tử tự do (L) tại nồng độ [L], tỷ lệ với nồng độ [L]:
1) Phản ứng ΔH298 ΔG
Phản ứng ΔH298 ΔG298 (13) -821,6 -806,2 (14) -841,8 -821,6 (15) -782,4 -758,2 (16) -569,3 -536,2 (17) -707,3 -688,5 (18) -836,7 -808,9
3.1.4.2. Nghiên cứu thực nghiệm sử dụng phức Hg2L2 làm sensor huỳnh quang để phát hiện các biothiol
a. Khảo sát phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của phức Hg2L2
Phức chất Hg2L2 được sử dụng để xác định phân tử sinh học có chứa thiol trong dung dịch nước. Cys được đưa vào dần dần trong dung dịch của Hg2L2, các đường cong chuẩn độ đã được mô tả ở Hình 3.24.
Hình 3.24. Phổ chuẩn độ UV-Vis (a) và phổ huỳnh quang (b) của dung dịch Hg2L2 (2,5 μM) trong C2H5OH/HEPES (1/9, v/v), pH=~7,4, ở 25°C khi thêm 0-10 μM
Hình 3.24a cho thấy, khi tăng dần Cys vào dung dịch phức Hg2L2, trong phổ UV-Vis thu được, đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 460 nm dần dần biến mất, đồng thời xuất hiện một đỉnh hấp thụ cực đại mới với cường độ hấp thụ rất mạnh ở bước sóng 540 nm. Thêm vào đó một điểm isosbestic xuất hiện tại bước sóng 490 nm. Khi nồng độ Cys thêm vào dung dịch đúng bằng một đương lượng so với Hg2L2, phổ UV-Vis thu được hoàn toàn phù hợp với phổ UV-Vis của dung dịch L tự do có cùng nồng độ. Kết quả này có thể giải thích là do Cys đã phản ứng với Hg2L2 và giải phóng L tự do, làm thay đổi phổ hấp thụ. Tương tự, Hình 3.24b cho thấy, dung dịch Hg2L2 hầu như không phát huỳnh quang ở bước sóng 585 nm. Khi thêm dần Cys vào dung dịch Hg2L2, cường độ huỳnh quang tăng dần trở lại. Khi lượng Cys thêm vào đạt một đương lượng, cường độ huỳnh quang dung dịch ở bước sóng 585 nm đạt khoảng 95% so với cường độ huỳnh quang của dung dịch L tự do có cùng nồng độ ban đầu. Kết quả này một lần nữa cho thấy Cys đã phản ứng với Hg2L2 và giải phóng L tự do.
b. Khảo sát ảnh hưởng của các amino acids cạnh tranh và phản ứng của Hg2L2 với các biothiol
Để đánh giá độ chọn lọc của sensor (phức Hg2L2) đối với các amino acids, tương tác giữa phức Hg2L2 (2,5 μM) với các amino acids (10 μM cho mỗi amino acid) trong dung dịch HEPES (10 mM, pH =7,4) đã được khảo sát ở Hình 3.25. Kết quả trình bày ở Hình 3.25a cho thấy, chỉ có các amino acids có chứa nhóm thiol, bao gồm Cys, GHS và Hcy mới làm thay đổi mạnh mẽ cường độ huỳnh quang của dung dịch, kết quả này phù hợp với tính toán lý thuyết. Cys làm phục hồi cường độ huỳnh quang đạt đến trên 95% so với cường độ huỳnh quang của dung dịch L tự do có cùng nồng độ (5 μM). Sự phục hồi cường độ huỳnh quang giảm dần theo thứ tự Cys > GSH > Hcy. Trong khi đó, các amino acids khác không chứa nhóm thiol bao gồm alanine (Ala), aspartic (Asp), arginine (Arg), glycine (Gly), glutamic (Glu), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), methionine (Met), threonine (Thr), serine (Ser), tyrosine (Tyr), tryptophan (Trp), valine (Val), và histidine (His), hầu như không làm thay đổi tín hiệu huỳnh quang của dung dịch phức Hg2L2. Điều này chỉ ra rằng có thể sử dụng phức Hg2L2 như một sensor huỳnh quang để phát hiện
chọn lọc các biothiol trong sự hiện diện của các amino acids không chứa nhóm thiol.
Hình 3.25. (a) Phổ huỳnh quang của Hg2L2(2,5 μM) trong C2H5OH/HEPES (pH =7,4, 1/9, v/v) tại 25 oC khi thêm các amino acids khác nhau (mỗi loại 10 μM), bao gồm Cys, Hcy, GSH, Ala, Asp, Arg, Gly, Glu, ILe, Leu, Lys, Met, Thr, Ser, Tyr, Trp, Val, và His
(Others: hỗn hợp gồm tất cả các amino acids kể trên ngoại trừ Cys, Hcy và GSH).
(b)Cường độ huỳnh quang (ở bước sóng phát quang 585 nm) của dung dịch Hg2L2
(2,5 μM) với các nồng độ khác nhau của Cys, GSH, Hcy, và các amino acids khác
Sự phục hồi cường độ huỳnh quang giảm dần theo thứ tự Cys > GSH > Hcy có thể giải thích là do hằng số cân bằng tạo phức Hg(RS)2, (2Hg(II) + 2RSH = Hg(SR)2 + 2H+, Ka) của Cys xấp xỉ bằng GSH và lớn hơn so với Hcy [148]. Ngoài ra, đối với Cys còn có phản ứng hình thành phức [Hg(RSH)2]2+ với Ka=1061,79 (2Hg(II) + 2RSH = Hg(RSH)2, Ka) [10]; với GSH còn có phản ứng hình thành phức Hg(RS)+ là 1035,68 (Hg(II) + RS- = Hg(RS)+, Ka) [109].
Sự thay đổi cường độ huỳnh quang của dung dịch Hg2L2 theo các nồng độ khác nhau của từng biothiol cũng đã được khảo sát và trình bày ở Hình 3.25b. Kết quả thí nghiệm cho thấy, khi tăng dần nồng độ Cys, GSH và Hcy từ 0 đến 5 μM vào dung dịch Hg2L2 (2,5 μM), cường độ huỳnh quang của dung dịch tăng tuyến tính với nồng độ các biothiol. Điều này cho thấy, có thể sử dụng Hg2L2 (2,5 μM) để phát hiện Cys, GSH và Hcy trong khoảng nồng độ từ 0 đến 5 μM. Trong đó, cường độ huỳnh quang tăng mạnh nhất là Cys, tiếp đến là GSH, Hcy. Sau đó, nếu tiếp tục
thêm các biothiol vào dung dịch Hg2L2, cường độ huỳnh quang của dung dịch tăng không đáng kể.
Thời gian của phản ứng giữa sensor Hg2L2 với Cys đã được khảo sát. Kết quả, phản ứng này xảy ra rất nhanh, khoảng vài giây, nhanh hơn nhiều so với các sensor tương tự đã công bố trước đây (10-40 phút) [39], [48], [154], [163], [189]. c. Khảo sát sử dụng Hg2L2 phát hiện định lượng Cys
Khả năng sử dụng phức Hg2L2 để phát hiện định lượng Cys đã được khảo sát và trình bày ở Hình 3.26. Kết quả khảo sát cho thấy, trong khoảng nồng độ Cys từ 0 đến 5 μM, cường độ huỳnh quang dung dịch Hg2L2 (2,5 μM) có mối quan hệ tuyến tính rất tốt với nồng độ Cys, thể hiện bởi phương trình
Hình 3.26. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa cường độ huỳnh quang dung dịch Hg2L2
(2,5 μM) với Cys tại 585 nm
(μM)
Hình 3.27. Đồ thị xác định LOD và LOQ Cys bằng Hg2L2: 2,5 μM, trong C2H5OH/HEPES (1/9, v/v), pH =7,4, bước sóng huỳnh quang 585 nm
F585 = (11,1 ± 5,9) + (133,3 ± 2,0) × [Cys], với R = 0,998 (N=14, P<0,0001).
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Cys bằng phương pháp đường chuẩn ở nồng độ bé (Hình 3.27; các số liệu thực nghiệm được đính kèm ở Bảng 3. PL54 và Bảng 4. PL55) tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM, thấp hơn nhiều so với nồng độ của Cys trong tế bào ở người (30-200 μM) [59], nhạy hơn nhiều so với các sensor tương tự đã công bố trước đây [23], [112], [140], [155]. Cys bằng Hg2L2 đã được đánh giá
Độ chính xác của phương pháp phát hiện thông qua độ lặp lại và độ thu hồi (Rev). Kết quả
Độ chính xác của phương pháp phát hiện Cys bằng Hg2L2 đã được đánh giá thông qua độ lặp lại và độ thu hồi (Rev). Kết quả khảo sát độ lặp lại (nồng độ Cys là 250 ppb, n=10) có độ lệch chuẩn tương đối RSD=7,8%, nhỏ hơn 0,5RSDH =9,9 (RSDH là độ lệch chuẩn tương đối tính theo hàm Horwitz). Độ thu hồi trong khoảng từ 92,1% đến 107,9%, thỏa mãn điều kiện <0,5RSDH. Điều này cho thấy có thể sử dụng Hg2L2 để xác định Cys với kết quả đáng tin cậy [105].
Kết quả khảo sát ở Hình 3.28 cho thấy rằng, quá trình hình thành phức Hg2L2 và quá trình phân ly phức giải phóng L xảy ra thuận nghịch, thể hiện qua sự đáp ứng tắt-bật (OFF/ON) huỳnh quang rất nhanh. Cụ thể, khi thêm một đương lượng ion Hg(II) vào dung dịch L dẫn đến sự dập tắt huỳnh quang. Tiếp theo, khi bổ sung thêm một đương lượng Cys, huỳnh quang dung dịch trở lại gần như ban đầu của dung dịch L tự do. Thí nghiệm cũng cho thấy, sau 5 chu kỳ luân phiên thêm một đương lượng ion Hg(II), rồi đến một đương lượng Cys, cường độ huỳnh quang dung dịch có giảm, nhưng không đáng kể so với dung dịch L tự do ban đầu, có thể khôi phục được hơn 80% cường độ huỳnh quang sau 5 chu kỳ. Kết quả này cho thấy, phương pháp này có thể tái sử dụng sensor khi xác định ion Hg(II) và Cys.
Hình 3.28. Cường độ huỳnh quang dung dịch L (5 μM) tại 585 nm khi thêm luân phiên một đương lượng ion Hg(II) và Cys trong 10 vòng (Hg(II): 5 μM, Cys:5 μM,