Xác định hàm lượng HCA trong mẫu bằng phương pháp HPLC

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

3.2.7. Xác định hàm lượng HCA trong mẫu bằng phương pháp HPLC

Phương pháp chuẩn độ axit - bazơ có thể sử dụng để xác định axit hữu cơ trong dịch chiết, phương pháp này giúp ta xác định được tổng lượng axit có trong dịch chiết. Tuy nhiên, trong phương pháp này không thể định lượng axit (-) hyđroxy xitric và axit xitric một cách riêng biệt. Ta cũng có thể xác định các axit bằng phương pháp sắc kí khí, trong phương pháp sắc kí khí ta phải sấy mẫu. Nhưng axit HCA sẽ bị lacton hoá khi có tác nhân nhiệt. Trong phương pháp sắc kí lỏng cao áp, ta có thể định lượng HCA và các axit hữu cơ khác mà không cần phải cô đặc, sấy, hoá hơi dung dịch chiết. Đây là điểm thuận lợi để có thể định lượng (-)-HCA và các axit hữu cơ một cách riêng biệt.

3.2.7.1. Chuẩn bị HCA tự do

Chất chuẩn: (-)-Calcium threo-hydroxyxitrat tribasic hydrate, cung cấp bởi hãng Sigma-Aldrich, công thức C12H10Ca3O16.xH2O. Thông tin chi tiết của chất chuẩn như sau:

Tên sản phẩm : (-)-Calcium threo-hydroxyxitrat tribasic hydrate, BioChemika, Garcinia Cambogia Extract, ~19,5% Ca.

Số sản phẩm : 55128 Văn phòng sản xuất : Fluka.

Công thức phân tử : C12H10Ca3O16.xH2O.

Khối lượng phân tử : 530,43 (cơ bản khan).

Màu sắc : Hơi nâu.

Dạng tồn tại : Bột.

Chuẩn độ (trao đổi ion) : Axit threo-hidroxi xitric 67,3%.

Hàm lượng cacbon : 24,11%.

Hàm lượng Hiđro : 2,82%.

34 Phổ 1HNMR : Phù hợp.

Toàn bộ những thông tin trên được ghi trong Giấy chứng nhận chất lượng ngày 4 tháng 2 năm 2005 của hãng Sigma-Aldrich.

Hình 3.16. Lọ chất chuẩn

Chuẩn bị HCA tự do: Calcium threo-hydroxyxitrat tribasic hydrate (50mg) cho vào cốc 50ml chứa 5ml nước, và xử lý với 500mg Dowex 50 [H+]. Hỗn hợp được khuấy trong thời gian 10 phút, sử dụng khuấy từ. Tách lấy phần dung dịch, và nhựa được rửa với nước có pH trung tính. Nước rửa và dung dịch được trộn lẫn tới thể tích 25ml, khuấy trộn và lọc bằng giấy lọc. Chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 10ppm đến 320ppm.

3.2.7.2. Xây dựng đường chuẩn

Hệ thống sắc ký lỏng cao áp được sử dụng để nghiên cứu gồm máy sắc kí

lỏng cao áp hãng Knauer trang bị với bơm loại áp suất thấp hãng Knauer, và lắp cột sắc kí Knauer C18: 250 mm x 4,6 ID x 5m. Bộ tổng hợp dung môi: quaternary LP Gradient, hãng Knauer. Quá trình dò được thực hiện bằng đetectơ Knauer UV:

khoảng bước sóng 190- 740 nm. Pha động gồm (A) metanol MeOH và (B) là H3PO4

0,01 M với tốc độ dòng 1,5 ml/m. Quá trình tách các pic tốt khi chất A trong B thay đổi từ 10-30% trong thời gian 0-25 phút, 90% A trong B trong thời gian 30 phút, sau 5 phút cân bằng với 90% A. Chất chuẩn và mẫu được lọc qua Millipore lọc 0,45

m và tiêm vào HPLC.

Phương pháp xây dựng đường chuẩn được thực hiện bằng cách dựa vào kết quả phân tích một chuỗi các mẫu HCA chuẩn. Năm mẫu dung dịch chuẩn chứa 10- 32ppm HCA tự do được tiêm vào HPLC, thao tác rửa giải được thực hiện như phần thảo luận ở trên, và kết quả thu được các diện tích pic. Đường cong HCA

35 được vẽ dựa trên biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ của HCA và diện tích pic (trung bình của 3 lần chạy).

Khoảng nồng độ mẫu chuẩn cần để xây dựng đường chuẩn được xác định dựa vào nồng độ thực của HCA có trong mẫu. Khoảng nồng độ này tính từ giá trị

giới hạn dưới (LLOQ) đến giá trị giới hạn trên (ULOQ).

Xác định giá trị giới hạn: Giá trị giới hạn (LOQ) được định nghĩa như nồng độ thấp nhất của HCA mà có thể xác định với độ tin cậy và chính xác <20%.

Xác định axit hữu cơ có trong mẫu: Mẫu được chuẩn bị bằng cách pha loãng theo tỉ lệ 1:100 với nước cất 2 lần cất, vỏ quả chưng ninh với nước cất tỉ lệ 1:50.

Thể tích của mỗi mẫu được tiêm vào HPLC là 20l, HCA thu được trực tiếp dựa vào diện tích pic, bằng cách áp dụng hệ số pha loãng và sử dụng đường chuẩn.

Nồng độ của HCA trong mẫu được tính bằng g/100g mẫu dựa theo công thức sau:

 

000 . ) 10

%  (     

Mn

Kpl Vdm Int

Am HCA SI

Trong đó: SI: hệ số góc đường chuẩn; Int: hệ số b của đường chuẩn; Am:

diện tích pic sắc kí; Vdm: thể tích mẫu sau khi cô đặc dùng cho HPLC; Kpl: hệ số pha loãng; Mn: khối lượng mẫu (gam).

Đường chuẩn được xác định bằng cách thay đổi nồng độ của 5 mẫu chuẩn.

Đường chuẩn được xây dựng với nồng độ từ 10 đến 320ppm.

Phương trình đường chuẩn: C = 1,37A – 6,88 với A là diện tích pic của HCA, C là nồng độ HCA, hệ số tương quan R2 = 0,999698

Hình 3.17: Đường chuẩn HCA

36 3.2.7.3. Kết quả định lượng HCA bằng phương pháp HPLC

Thành phần HCA xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp được tính bằng công thức:

Lượng HCA (ppm) = (1.37*Am- 6.88)*Vđm*Kpl/Mm Lượng HCA (g/100g) = Cm (ppm)/10000

Trong đó: Cm(ppm) : Nồng độ tính bằng ppm Cm% : Nồng độ phần trăm Am : Diện tích pic sắc ký Vđm : Thể tích mẫu cô đặc (ml) Kpl : Hệ số pha loãng

Mm : Trọng lượng mẫu thử (g)

Kết quả xác định HCA trong vỏ quả bứa bằng phương pháp HPLC được thể hiện trong bảng 3.6 và sắc ký đồ hình 3.4.

Hình 3.18. Sắc ký đồ mẫu HCA chuẩn và axit citric chuẩn

Nhận xét: Pic của axit HCA chuẩn xuất hiện ở thời gian lưu là 4,939 phút, tương tự pic của axit citric chuẩn xuất hiện ở thời gian lưu là 5,623 phút

37

Hình 3.19. Sắc ký đồ mẫu vỏ bứa khô chiết được ở qui mô 10g

Bảng 3.6. Kết quả xác định hàm lượng HCA bằng phương pháp HPLC mẫu chiết ở qui mô 10g

STT mẫu m (g) Am Vcđ Kpl HCA (%)

1 10,087 171,303 50 100 11,292

2 10,000 171,839 50 100 11,427

Nhận xét:

- Thời gian lưu của HCA tìm thấy trong mẫu là 4,955 gần với thời gian lưu của HCA chuẩn

- Dựa vào kết quả thu được, hàm lượng HCA thu được là 11,359% ứng với điều kiện chiết trong nồi áp suất ở nhiệt độ 1270C, áp suất 0,15 Mpa, thời gian chiết là 60 phút, tỉ lệ rắn lỏng 10g/200ml.