giai đoạn tạo nguồn nguyên liệu ban đầu cho các q trình nhân giớng tiếp theo. Nếu như bước tái sinh mẫu khơng thành cơng thì quy trình nhân giớng in vitro cũng không thể tiến hành. Để tiến hành tái sinh mẫu trước hết cần phải tiến hành khử trùng mẫu cho phù hợp với từng loại đối tượng cũng như từng loại mẫu khác nhau. Nguồn mẫu cây Rễ gió đưa vào ni cấy trong các thí nghiệm được lấy từ đoạn thân chứa chồi ngủ thu thập ngoài tự nhiên nên chứa rất nhiều loại vi sinh vật. Vì vậy, cần lựa chọn nồng đợ, thời gian chất khử trùng thích hợp để loại bỏ hoàn toàn mầm bệnh khỏi mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy.
Trong quá trình vô trùng mẫu để tiêu diệt nấm và vi khuẩn trên mẫu nuôi cấy, các nhà nghiên cứu thường sử dụng các chất hoá học có hoạt tính tiêu diệt nấm và vi khuẩn. Một số chất thường được sử dụng để khử trùng mẫu nuôi cấy như: Oxi già hydroxid (H2O2), Calcium hypochlorid Ca(OCl)2, thuỷ ngân clorua (HgCl2),…
H2O2 là mợt trong các hoá chất có khả năng tiêu diệt nấm và vi khuẩn, không gây ảnh hưởng lớn đến mơi trường như thủy ngân, vì vậy nên những năm gần đây các thí nghiệm về nuôi cấy mô đã dần thay thế các chất như thủy ngân clorua bằng oxi già để giảm ô nhiễm môi trường.Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn H2O2 là chất khử trùng để tạo vật liệu nuôi cấy vô trùng trong nghiên cứu của mình.
Để lựa chọn nờng đợ và thời gian khử trùng thích hợp cho cây Rễ gió chúng tơi đã thử nghiệm khả năng khử trùng với dung dịch H2O2 ở các nồng độ và thời gian khác nhau. Sau 7 ngày nuôi cấy kết quả thu được trình bày ở bảng sau
của H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng đoạn thân mang chời ngủ của lồi Rễ gió. (sau 7 ngày ni cấy)
Công thức Nồng độ (%) Thời gian (phút) Số mẫu đưa vào (mẫu)
Chỉ tiêu đánh giá
Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) CT1 (Đ/c) Nước cất vô trùng 15 30 0 100 0 CT2 H2O2 1% 10 30 17,78* 70 12,22 CT3 15 30 26,67* 57,78 15,56 CT4 20 30 38,89* 43,33 17,78 CT5 H2O2 2% 10 30 32,22* 53,33 14,44 CT6 15 30 48,89* 38,89 12,22 CT7 20 30 54,44* 23,33 22,22 CT8 H2O2 3% 10 30 42,22* 21,11 36,67 CT9 15 30 63,33* 18,89 17,78 CT10 20 30 55,56* 6,67 37,78 LSD05 1,48 CV (%) 4,2
Ghi chú: *: CT có sự sai khác ý nghĩa so với đối chứng
Xét tỷ lệ mẫu sống:
Từ kết quả ở bảng 4.1 cho thấy:
Các công thức thí nghiệm đều cho tỷ lệ mẫu sống cao hơn công thức đối chứng (0,00%), từ đó cho thấy nồng độ H2O2 và thời gian khử trùng có ảnh hưởng tích cực đến khả năng tiêu diệt nấm, vi khuẩn. H2O2 có cơ chất tiêu diệt khuẩn nấm là phá vỡ màng tế bào, không gây độc nhưng nếu mẫu nghiên cứu tiếp xúc ở nồng độ cao và thời gian dài sẽ gây chết mẫu.
CT10 có sự sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, các cặp CT khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%.
Ở chỉ tiêu mẫu sống từ CT2 đến CT10 cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất là CT9
(63,33%) và thấp nhất là CT2 (17,78%).
Ở chỉ tiêu mẫu sống nhiễm từ CT2 đến CT10 cho tỷ lệ mẫu sống nhiễm cao
nhất là CT2 (70%) và thấp nhất là CT10 (6,67%).
Ở chỉ tiêu mẫu chết từ CT2 đến CT10 cho tỷ lệ mẫu chết cao nhất là CT10
(37,78%) và thấp nhất là CT2 (12,22%).
- Dung dịch H2O2 ở nồng độ 1%: trong 20 phút cho tỷ lệ mẫu sống ở mức cao nhất đạt 38,89%, tỷ lệ mẫu sống nhiễm ở mức khá cao đạt 43,33% và tỷ lệ mẫu chết ở mức cao nhất đạt 17,78%.
- Dung dịch H2O2 ở nồng độ 2%: trong 20 phút cho tỷ lệ mẫu sống ở mức độ cao nhất đạt 54,44%, tỷ lệ mẫu sống nhiễm ở mức thấp đạt 23,33% và tỷ lệ mẫu chết khá cao đạt 22,22%.
- Dung dịch H2O2 ở nồng độ 3%: trong thời gian 15 phút cho tỷ lệ mẫu sống ở mức độ cao nhất đạt 63,33%, mẫu sống nhiễm và mẫu chết khá thấp lần lượt ở mức 18,89% và 17,78%.
Kết quả thí nghiệm cho thấy dung dịch H2O2 ở nồng độ thấp nhất 1% ít ảnh hưởng đến mẫu, tỷ lệ mẫu chết cao nhất ở mức 17,78% nhưng hiệu quả khử trùng thấp, tỷ lệ mẫu sống nhiễm cao nhất 70%. Khi nồng độ H2O2 tăng lên 3% thì hiệu quả của khử trùng của H2O2 khá cao, tỷ lệ mẫu sống đạt mức cao nhất 63,33% khử trùng trong 15 phút nhưng khi tăng lên theo thời gian khử trùng lên 20 phút thì tỷ lệ mẫu sống giảm mạnh xuống 55,56% và tỷ lệ mẫu chết cao nhất 37,78%. Điều này cho thấy nếu H2O2 nồng độ và thời gian không phù hợp thì sẽ không đạt hiệu quả khử trùng tốt nhất.
Nồng độ H2O2 và thời gian khử trùng phù hợp và tốt nhất trong thí nghiệm là CT9 có H2O2 nờng đợ 3% thời gian khử trùng 15 phút cho tỷ lệ mẫu sống đạt 63,33% và tỷ lệ mẫu chết ở mức tương đối thấp 17,78%.