E. coli M15 (pREP4) cho phép biểu hiện protein vượt mức bằng hệ thống vector biểu hiện pQE. Chủng này có mang plasmid pREP4 mang gene lacI mã hóa cho repressor lacI có vai trò ức chế sự phiên mã của gene nằm sau promotor T5 theo cơ chế kiểm soát âm khi không có chất cảm ứng. Chủng E. coli M15 (pREP4) có kiểu gene [Nals, Strs, Rifs, Thi-, Lac-, Ara+, Gal+, Mtl-, F-, RecA+, Uvr+, Lon+]. Một chủng khác có đặc điểm tương tự như M15 (pREP4) là SG13009 (pREP4). Ngoài ra, có thể dùng một số chủng khác để biểu hiện hệ thống pQE như
E.coli XL1 Blue, E. coli TG1. Tuy nhiên, chỉ có các chủng mang pREP4 cho hiệu quả biểu hiện cao và tránh được hiện tượng rò rỉ phiên mã [32].
2.6. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới. 2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Hiện các nghiên cứu trong nước về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis
KOD1 và các gen đặc trưng là không có, các nghiên cứu xuất hiện chỉ liên quan đến việc nghiên cứu tạo vector T bắt nguồn từ vi khuẩn suối nước nóng phục vụ cho việc biến nạp và tạo dòng, nổi bật trong các công trình nghiên cứu là sản phẩm chế tạo vector T-TUAF của TS. Dương Văn Cường- Phó Khoa Công nghệ Sinh học và Công 14 nghệ Thực phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên.
Một số công ty công ty hoạt động trong lĩnh vực công nghệ sinh học tập trung vào việc thiết kế mồi đặc hiệu cho việc bắt cặp đặc hiệu từng đoạn gen trong hệ gen của Thermococcus kodakarensis KOD1 (công ty trách nhiệm hữu hạn một thành viên sinh hóa Phù Sa, Tỉnh Vĩnh Long). Các nghiên cứu về gen OsmC2 và khả năng enzyme chịu đựng của tế bào với áp suất thẩm thấu hầu như là không có.
2.6.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Các sinh vật tăng thân nhiệt đã trở thành vi sinh vật mô hình được nghiên cứu rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau tập trung vào sự thích nghi của chúng với nhiệt độ khắc nghiệt, phát sinh loài và tiến hóa bộ gen, giải mã phân tử các cơ chế sao chép DNA trong Archaea và các nguồn có giá trị của các sản phẩm công nghệ sinh học quan trọng.
Đại học Dược Kyoritsu ở Nhật Bản đã đưa Thermococcus koadakarensis vào một nghiên cứu liên quan đến mức độ acetylcholine trong các dạng sống sinh học thiếu hệ thần kinh. Acetylcholine là một hợp chất hóa học được tìm thấy trong hệ thần kinh. Họ đo mức độ acetylcholine bằng cách sử dụng radioimmunoassays (RIA). Họ đã lấy mẫu nồng độ acetylcholine từ các sinh vật của từng miền của cây phát sinh chủng loài của sự sống. Cặp nhiệt điện kodakarensis đại diện cho vùng Archaea. Những phát hiện của nghiên cứu cho thấy biểu hiện phổ biến của acetylcholine đã là một "chất trung gian địa phương và bộ điều biến các chức năng sinh lý kể từ khi bắt đầu cuộc sống." (Kawashima K. và cộng sự).
Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về Thermococcus và nghiên cứu hoàn thiện trình tự genome của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1, của viện nghiên cứu hóa sinh tổng hợp, Trường Đại Học Kyoto, thuộc Katsura, Nashikyo-ku, Nhật Bản, tháng 3 năm 2005. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chi Thermococcus, bao gồm các vi khuẩn cổ Hyperthermophilic, các thành viên của Thermococcus có mặt ở khắp nơi trong môi trường nhiệt độ cao, và đóng một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái và trao đổi chất hệ vi sinh vật hoạt động trong hệ sinh thái nước nóng. Fukui T và cs, 2005 đã xác định và ghi chú các bộ gen 2.088.737 - cơ sở hoàn chỉnh của Thermococcus kodakaraensis KOD1, theo sau là sự so sánh với ba bộ gen hoàn chỉnh của Pyrococcus spp. Tổng cộng có 2306 trình tự DNA mã hóa (CDS) đã được xác định, trong đó một nửa (1165 CDS) là chú thích, trong khi các chức năng của 41% (936 CDS) không thể được dự đoán từ các cấu trúc chính. Bộ gen chứa bảy gen chuyển có thể xảy ra và bốn khu vực có liên quan đến virus. Một trong số protein di truyền cho thấy sự tương đồng cao với nhóm Pyrococcus spp. Sự sắp xếp
Thermococcales, genomics trong so sánh làm rõ sự có mặt 1.204 của protein khác nhau, bao gồm những thông tin và trao đổi chất cơ bản, được chia sẻ giữa T. kodakaraensis và Pyrococcus spp. Mặt khác, còn cho thấy nhiệm vụ của các protein khác như tham gia vào quá trình chuyển hóa pyruvate, chuyển hóa nucleotide, vận chuyển kim loại ion [11]. Gần đây nhất là nghiên cứu của các nhà khoa học thuộc phòng thí nghiệm vi sinh, trường đại học Wageningen, Phần Lan vào tháng 7 năm
2015 [33] với nội dung 15 trình bày về số lượng nhiễm sắc thể của Thermococcus kodakarensis KOD1, các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra nhận định rằng các euryarchaeon Thermococcus kodakarensis là sinh vật kỵ khí dị dưỡng Hyperthermophilic đặc trưng và do sự sẵn có của các hệ thống kỹ thuật di truyền nó đã trở thành một trong những sinh vật mẫu cho giới Archaea. Mặc dù vai trò nổi bật này trong số các euryarchaeota, không sẵn có dữ liệu về mức độ sắp đặt trình tự của loài này. Cấu tạo thể đa bội có nhiều trong euryarchaeota, đặc biệt là Halobacteria, số lượng bản sao nhiễm sắc thể của loài thuộc một trong các đơn vị trong đơn vị cấu tạo nên giới đó, nghĩa là các Thermococcales (bao gồm Thermococcus spp. và
Pyrococcus spp.) chưa bao giờ được xác định. Trong nghiên cứu này, các nhà khoa học chứng minh rằng T. kodakarensis là sinh vật có cấu tạo đa bội với một số lượng bản sao nhiễm sắc thể mà thay đổi trong khoảng 7-19 bản sao, tùy thuộc vào giai đoạn tăng trưởng [33]. Còn rất nhiều các nghiên cứu khác trên thế giới về chủng vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1, giải trình tự các đoạn gen của nó và ứng dụng của nó trong nghiên cứu khoa học được đề cập trên các bài báo, tạp chí khoa học được công bố rộng trên các trang web đặc biệt là NCBI.
Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn cổ Thermococcus kodakaesis KOD1
- Vật liệu:
Mồi: Chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen OsmC2 của
Thermococcus kodakarensis KOD1 đã công bố trên ngân hàng gen (Genbank). Hai mồi mỗi đoạn dài 25 bp được thiết kế như sau:
FOS2 (NdeI) 5’CAT ATg Cgg ATC TgC CGG CTT TAT TAT C3’. ROS2 (XhoI) 5’gAG CTC ATg Aag CgC CTT gAg TAT TC3’
- Chủng giống:
Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 được phân lập từ nước biển Thái Bình Dương do trung tâm NITE Biological esource Nhật Bản cung cấp.
Vi khuẩn E.coli DH5α, JM109 dùng cho tách dòng và E.coli BL21 DE3 PlysS dùng cho biểu hiện do Viện Khoa học Sự sống – Đại học Thái Nguyên cung cấp.
Vector tách dòng pGEM-Teasy thương mại được cung cấp bởi Promega; Vector biểu hiện pET21b thương mại được cung cấp bởi Novagen.
3.1.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
- Hóa chất tách chiết DNA gồm: Ethanol, CTAB, CIAA, isoamyl alcohol, Nacl.
- Hóa chất thực hiện phản ứng PCR gồm: Buffer, dNTPs, Taq polymerase, mồi, nước khử ion.
- Hóa chất thực hiện điện di gồm: Có agarose, TAE1X, 0,5X, marker, ethidium bromide, EDTA, loading dye.
Bảng 3.1. Hóa chất sử dụng trong đề tài STT Tên hóa chất 1 Proteinase K 2 RNase 3 Isopropanol 4 Chloroform 5 Isoamin alcohol 6 Tris Base 7 Acid acetic 8 EDTA 9 Loading dye 10 Agarose 11 Ethidium bromide 12 Enzyme EcoRI 13 Enzyme SalI 14 Taq-polymerase 5U/ul 15 Buffer Taq-polymerase
16 dNTP: nucleotide tự do A,T,G,C
17 Bộ kit ADN purification
18 Bộ Kit GeneJET Plasmid miniprep K
19 Vector tách dòng pGEM-T easy
20 Vector biểu hiện pET28a
21 IPTG
3.1.3. Thiết bị , dụng cụ nghiên cứu
+ Dụng cụ nghiên cứu:
Dụng cụ cần sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài gồm có: Bình thủy tinh chịu nhiệt, bình tam giác, đầu type các loại, ống Eppendorf, gang tay, khẩu trang y tế, dao, giá để ống Eppendorf…..
+ Thiết bị nghiên cứu:
Bảng 3.2. Thiết bị nghiên cứu
STT Tên thiết bị
1 Bộ điên di đứng
2 Bộ điện di ngang
3 Máy Vortex
4 Cân điện tử
5 Máy cất nước
6 Máy PCR
7 Máy đo pH
8 Máy lắc
9 Máy ly tâm
10 Máy chụp gel
11 Máy spindown
12 Bể ổn nhiệt
13 Tủ lạnh -20ºC ; -80ºC
14 Tủ an toàn sinh học cấp 2
15 Nồi hấp khử trùng
3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Khoa CNSH - CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên.
3.2.2. Thời gian nghiên cứu
- Thời gian: Từ 1/2020 - 6/2021.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Sử dụng bộ kit DNA purification của Promega tách chiết DNA hệ gen của
-Bước 1: Chuyển 1 ml dịch khuẩn đã nuôi qua đêm vào ống effendoff 1.5 ml.
-Bước 2: Ly tâm 13000-16000 vòng trong 2 phút. Thu cặn tế bào.
-Bước 3: Làm tan cặn bằng 480 µl EDTA.
-Bước 4: Bổ sung 50 µl enzyme phân giải phù hợp (lysozyme) và trộn kĩ bằng pipet.
- Bước 5: Ủ mẫu ở 37oC trong 30 - 60 phút. Ly tâm 2 phút ở 13000-16000 vòng. Thu cặn loại bỏ dịch nổi.
- Bước 6: Bổ sung 600 µl Nucleic Lysis Solution. Trộn kỹ bằng pipet cho đến khi tan cặn hoàn toàn.
- Bước 7: Ủ ở 80°C trong 5 phút đế phân giải tế bào sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng.
- Bươc 8: Bổ sung 3 µl RNase Solution để loại bỏ RNA. Đảo trộn 2-5 lần.
- Bước 9: Ủ 37°C trong 15 - 60 phút. Làm nguội ở nhiệt độ phòng.
- Bước 10: Thêm 200 µl Proteinase. Vortex hỗn dịch trong 20 giây nhằm loại bỏ protein trong tế bào.
- Bước 11: Ủ mẫu đá trong 5 phút.
- Bước 12: Ly tâm 13000-16000 vòng trong 3 phút.
- Bước13: Chuyển dịch nổi vào ống effendoff 1.5 ml chứa 600 µl isopropanol.
- Bước 14: Trộn kỹ đến khi xuất hiện các vẩn trắng.
- Bước 15: Ly tâm 13000-16000 vòng trong 2 phút.
- Bước 16: Thu cặn và loại bỏ dịch nổi (thấm khô bằng giấy). Bổ sung 600 µl ethanol 70%. Trộn nhẹ để rửa cặn ADN.
- Bước 17: Ly tâm 13000-16000 vòng trong 2 phút. Loại hết toàn bộ cồn còn sót.
- Bước 18: Làm khô bằng cách thấm qua giấy. Để khô ở nhiệt độ phòng trong
10-15 phút.
- Bước 19: Bổ sung 100 µl of ADN Rehydration Solution vào ống chứa cặn ADN ủ ở 65°C trong 1 giờ. Làm tan cặn và ủ ở nhiệt độ phòng hoặc 4°C qua đêm.
3.3.2. Phương pháp khuếch đại gen PCR
Khuếch đại gen OsmC2 từ hệ gen của Thermococcus kodakarensis KOD1 theo quy trình ExTaq DNA polymerase của Takara Biotech Co. Ltd., Dalian, Trung Quốc. Sản phẩm PCR được tinh sạch qua bộ kit QAEX II gel extraction (Qiagen).
- Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen OsmC2
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen OsmC2
- Chu kì nhiệt nhân gen OsmC2
95o 95o
5’ 1’
3.3.3. Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến
Để nhân dòng hay biểu hiện vector trong tế bào, thì tế bào đó phải được xử lý để làm biến đổi cấu trúc màng nhằm tạo điều kiện cho sự khuếch tán ADN plasmid ngoại lai vào bên trong tế bào. Phương pháp tạo tế bào khả biến phổ biến, đơn giản thường là sử dụng CaCl2. Sau đây là quy trình tạo tế bào khả biến của Hanahan (1983) có sửa đổi [6].
- Bước 1: Chủng E. coli được nuôi qua đêm trên môi trường LB ở máy lắc 37ºC, 200 vòng/phút.
- Bước 2: Lấy 1 ml dịch nuôi cấy vào 100 ml môi trường LB lỏng, tiếp tục nuôi lắc 1,5 giờ ở 37ºC, 200 vòng/phút. Đến khi OD600 đạt 0,4 - 0,6.
- Bước 3: Đặt trong đá khoảng 10 phút.
- Bước 4: Ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút, thu cặn, loại bỏ dịch nổi.
- Bước 5: Bổ sung 30 ml CaCl2 0,1M, đảo trộn nhẹ cho tan đều.
- Bước 6: Ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút, thu cặn, loại bỏ dịch nổi.
- Bước 7: Bổ sung 60 µl CaCl2 và 30 µl glycerol 60%. Bảo quản ở tủ -80ºC.
- Bên cạnh việc chuẩn bị tế bào khả biến bằng CaCl2, còn sử dụng tế bào khả biến JM109 High – Efficiency do hãng Promega cung cấp.
3.3.4. Phương pháp gắn nối gen vào vecter
Tinh sạch sản phẩm PCR và gắn nối đoạn gen vào vector tách dòng pGEM
- Gen được tinh sạch theo quy trình của GenJET PCR Purification Kit, 50 preps, Code K0701.
- Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng STT
1 2X Rapid Ligation Buffer
2 pGEM- T Vector
3 Sản phẩm PCR
4 T4 ADN ligase (3 Weiss units/ µl)
3.3.5. Phương pháp tách chiết plasmid
Tách chiết plasmid theo GeneJET Plasmid miniprep Kit.
Phương pháp tách plasmid bằng bộ kit của Thermo Fisher Scientific.
- Bước 1: Ly tâm 5000 vòng/ phút thu cặn tế bào.
- Bước 2: Bổ sung 250 µl Resuspension buffer vào các ống tế bào, vortex đến khi tan hết cặn khuẩn.
- Bước 3: Bổ sung 250 µl Lysis buffer, đảo nhẹ 3 - 4 lần.
- Bước 4: Bổ sung 350 µl Neutralization buffer, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Bước 5: Hút dịch lỏng sang cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch lỏng.
- Bước 6: Bổ sung 700 µl Washing A buffer, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch lỏng.
- Bước 7: Ly tâm lần 2 ở 13000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn ethanol.
- Bước 8: Chuyển cột lọc sang ống eppendorf mới, bổ sung 50 µl Elution buffer,
đợi ít nhất 1 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu ADN plasmid.
- Bước 9: Chạy điện di mẫu cắt cần nghiên cứu, nhuộm gel bằng EtBr, đặt lên máy soi gel, quan sát và cắt đoạn gen mong muốn vào ống effendoff.
- Bước 10: Bổ sung 600 l dung dịch Binding buffer.
- Bước 11: Ủ 55 C trong 15 phút để gel tan hoàn toàn và kiểm tra màu hỗn hợp (vàng).
- Bước 12: Chuyển hỗn hợp gel tan sang cột QIA quick column và đặt vào ống thu mẫu.
- Bước 13: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
- Bước 14: Loại dịch qua cột và đặt ống trở lại ống thu mẫu.
- Bước 15: Bổ sung 500 l Wash buffer, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch qua cột.
- Bước 16: Đặt cột vào ống effendof mới, bổ sung 750 l Elution buffer, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu ADN. Bảo quản ở -20 C.
3.3.6. Phương pháp biến nạp
Phương pháp này được áp dụng theo quy trình do Promega cung cấp cho đối tượng E.coli JM109
- Bước 1: Bổ sung 2 µl vector tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ.
- Bước 2: Hỗn hợp được đặt trong đá 20 phút. Xử lý sốc nhiệt ở 42ºC trong 1 phút 30 giây.
- Bước 3: Sau khi sốc nhiệt, hỗn hợp được đặt ngay vào đá trong thời gian 5 phút.
- Bước 4: Bổ sung 150 - 300 µl môi trường LB lỏng. Hỗn hợp được nuôi ở 37ºC, lắc 200 vòng/phút trong vòng 1 giờ.
- Bước 5: Sử dụng que cấy trải đã khử trùng trải 150 - 250 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trường LB đặc có chứa kháng sinh phù hợp (100 mg/l Ampicillin, X-gal 0,004 %, IPTG 100 µM). Ủ đĩa petri ở 37ºC qua đêm trong vòng 16 giờ.
3.3.7. Phương pháp kiểm tra gắn nối gen
- Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NdeI và XhoI
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NdeI và XhoI