Tách chiết plasmid theo GeneJET Plasmid miniprep Kit.
Phương pháp tách plasmid bằng bộ kit của Thermo Fisher Scientific.
- Bước 1: Ly tâm 5000 vòng/ phút thu cặn tế bào.
- Bước 2: Bổ sung 250 µl Resuspension buffer vào các ống tế bào, vortex đến khi tan hết cặn khuẩn.
- Bước 3: Bổ sung 250 µl Lysis buffer, đảo nhẹ 3 - 4 lần.
- Bước 4: Bổ sung 350 µl Neutralization buffer, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Bước 5: Hút dịch lỏng sang cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch lỏng.
- Bước 6: Bổ sung 700 µl Washing A buffer, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch lỏng.
- Bước 7: Ly tâm lần 2 ở 13000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn ethanol.
- Bước 8: Chuyển cột lọc sang ống eppendorf mới, bổ sung 50 µl Elution buffer,
đợi ít nhất 1 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu ADN plasmid.
- Bước 9: Chạy điện di mẫu cắt cần nghiên cứu, nhuộm gel bằng EtBr, đặt lên máy soi gel, quan sát và cắt đoạn gen mong muốn vào ống effendoff.
- Bước 10: Bổ sung 600 l dung dịch Binding buffer.
- Bước 11: Ủ 55 C trong 15 phút để gel tan hoàn toàn và kiểm tra màu hỗn hợp (vàng).
- Bước 12: Chuyển hỗn hợp gel tan sang cột QIA quick column và đặt vào ống thu mẫu.
- Bước 13: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
- Bước 14: Loại dịch qua cột và đặt ống trở lại ống thu mẫu.
- Bước 15: Bổ sung 500 l Wash buffer, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch qua cột.
- Bước 16: Đặt cột vào ống effendof mới, bổ sung 750 l Elution buffer, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu ADN. Bảo quản ở -20 C.
3.3.6. Phương pháp biến nạp
Phương pháp này được áp dụng theo quy trình do Promega cung cấp cho đối tượng E.coli JM109
- Bước 1: Bổ sung 2 µl vector tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ.
- Bước 2: Hỗn hợp được đặt trong đá 20 phút. Xử lý sốc nhiệt ở 42ºC trong 1 phút 30 giây.
- Bước 3: Sau khi sốc nhiệt, hỗn hợp được đặt ngay vào đá trong thời gian 5 phút.
- Bước 4: Bổ sung 150 - 300 µl môi trường LB lỏng. Hỗn hợp được nuôi ở 37ºC, lắc 200 vòng/phút trong vòng 1 giờ.
- Bước 5: Sử dụng que cấy trải đã khử trùng trải 150 - 250 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trường LB đặc có chứa kháng sinh phù hợp (100 mg/l Ampicillin, X-gal 0,004 %, IPTG 100 µM). Ủ đĩa petri ở 37ºC qua đêm trong vòng 16 giờ.
3.3.7. Phương pháp kiểm tra gắn nối gen
- Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NdeI và XhoI
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NdeI và XhoI STT
1 10X FastDigest Buffer
2 Plasmid (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3 FastDigest Enzyme NdeI
4 FastDigest Enzyme XhoI
5 Nước khử ion
Tổng thể tích
Hỗn hợp được ủ 37 C trong 15 phút.
3.3.8. Phương pháp cảm ứng biểu hiện protein bằng IPTG
- Bước 1: Cảm ứng biểu hiện gene trong vi khuẩn E. coli bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi khuẩn isopropyl-β-galactopyranoside (IPTG) với nồng độ 1 mM.
- Bước 2: Dung dịch nạp mẫu và 7 μl mẫu protein vào ống eppendorf 0,2 ml sạch, trộn đều, đậy nắp và gia nhiệt ở 95ºC từ 3-5 phút gây biến tính protein.
- Bước 3: Sau khi gia nhiệt có thể ly tâm 10 000 vòng/phút trong 3 phút.
- Bản gel được chạy ở 1 hiệu hiện thế từ 1-8 V/cm.
- Bước 4: Khi quá trình điện di kết thúc, tháo rời các bản kính và đặt chúng vào giá. Kiểm tra chất lượng bản gel. Sau đó nhuộm với EtBr, SYBR gold hoặc làm khô gel.
3.3.9. Phương pháp tinh sạch protein
- Dựa vào tính chất của protein mà sẽ đưa ra các biện pháp chiết rút và tinh sạch khác nhau. Phương pháp dưới đây sử dụng tính chất lưỡng tính của protein để tách protein khỏi hỗn hợp ban đầu thông qua muối trung tính và nồng độ pH.[7]
- Bước 1: Chọn dòng vi khuẩn đã biểu hiện thành công gene OsmC2.
- Bước 2: Bổ sung 1 mM (IPTG) khi nồng độ OD600 của môi trường nuôi đạt ~ 0.6 nuôi 37oC trong 4h để kích hoạt vùng operon của đoạn gene.
- Bước 3: Ly tâm dịch khuẩn ở 6000 vòng/phút trong 10 phút để thu tế bào. Phân giải tế bào với Tris buffer (50 mM TrisHCl, 50 mM NaCl, pH 8.0).
- Bước 4: Sản phẩm sau khi được phân giải được thu lại bằng đặt vào màng lọc
đường kính 0,22 m và ly tâm 14000 vòng/ phút trong 20 phút ở 4oC. Cho phần dịch chảy qua cột sắc ký trao đổi ion Macro-Prep High Q (BIO-RAD) với đệm đẩy Tris.
- Bước 5: Rửa giải bằng dung dịch đệm với các gradient nồng độ muối NaCl tăng dần hoặc với gradient pH (nhờ sự bổ sung axit lactic pH 4,5).
- Bước 6: OsmC2 tiếp tục được tinh sạch bằng cách đưa vào cột superdexTM 200 10/300 (GE Healthcare).
- Bước 7: Sau khi qua các bước ly trích và tinh sạch, sản phẩm đều được kiểm tra lại độ tinh sạch của protein nhờ kỹ thuật điện di trên gel SDS-PAGE 12,5% (Hames, 1998) [13]. Tất cả các bước đều được thực hiện ở 4oC để bảo vệ hoạt tính của enzyme.
3.3.10. Phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE
Dựa theo quy trình chung do Hames (1998) [13] đưa ra kỹ thuật điện di trên gel SDS-PAGE được thực hiện theo các bước sau:
* Pha gel phân tách (separating gel) có nồng độ 12%T
- Bước 1: Cho các thành phần sau theo thứ tự vào ống Falcon 15 ml sạch: 4 ml 30% Acrylamide/Bis (29:1); 2,5 ml Tris HCL 1,5M pH 8,8; 3,4 ml nước cất 2 lần khử ion, 0,1 ml 10% SDS.
- Bước 2: Sau khi cho đầy đủ vào ống Falcon 50 μl TEMED và 50 μl ammonium persulfate 10% và lắc nhẹ ống vài lần (tránh tạo bọt).
- Bước 3: Dùng pipette bơm từ từ gel vào khuôn, đổ gel sao cho mức dung dịch gel cao hơn 7 cm (tránh tạo bọt trong khuôn).
- Bước 4: Sau đó, nhẹ nhàng đặt một lớp nước cất lên trên lớp gel để mặt gel được phẳng.
- Bước 5: Chờ gel đông trong 20-30 phút. Với 10 ml dung dịch gel có thể độ được gel 100 x 100 x 0,75 mm.
* Pha gel cô (Stacking gel) có nồng độ 4%T (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Bước 1: Cho các thành phần sau theo thứ tự vào ống Falcon 15 ml khác: 1,3 ml Acrylamide/Bis (29:1) 30%; 2,5 ml Tris HCl 0,5 M 6,8; 6,1 ml nước cất 2 lần khử ion 0,1 ml SDS 10%.
- Bước 2 : Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn, đổ hết nước bên trên (dùng giấy thấm hết nước còn sót).
- Bước 3: Tiến hành đổ lớp gel cô bằng pipette hút 2 ml dung dịch gel cô vào becher 50 ml, thêm vào 2 μl dung dịch TEMED và 10 μl ammonium persulfate 10%.
- Bước 4 : Dùng pipette trộn đều và bơm vào khuôn gel. Đồng thời đưa lược vào gel để tạo giếng chứa mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn).
- Bước 5 : Tiếp theo ta lắp bản gel vào bộ phận điện di, cho dung dịch điện di vào bể.
* Chuẩn bị dung dịch nạp mẫu (sample buffer) và dung dịch đệm điện di (electrode buffer)
- Bước 1: Pha dung dịch nạp mẫu gồm: 3,55 ml nước cất 2 lần khử ion; 1,25 ml Tris HCl 0,5 M pH 6,8; 2,5 ml glycerol; 2 ml SDS 10% (w/v); 0,2 ml bromophenol blue 0,5% (w/v).
- Bước 2: Khi dùng thêm vào 50 μl 2- Mercraptoethanol hoặc 0,5 ml dithiothreitol 2 M (DTT).
- Bước 3: Dung dịch điện di bao gồm: Tris – glycine, pH 8,3. Pha 1l Tris – Glycine (196 mM glycine, 0,1% SDS, 50 mM Tris – HCl pH 8,3).
- Chuẩn bị mẫu và chạy điện di
- Bước 1: Dùng pipette hút 3 μl dung dịch nạp mẫu và 7 μl mẫu protein
vào ống eppendorf 0,2 ml sạch, trộn đều, đậy nắp và gia nhiệt ở 95oC từ 3-5 phút gây biến tính protein.
- Bước 2: Sau khi gia nhiệt có thể ly tâm 10 000 vòng/phút trong 3 phút.
- Bản gel được chạy ở 1 hiệu điện thế từ 1-8 V/cm.
- Bước 3: Khi quá trình điện di kết thúc, tháo rời các bản kính và đặt chúng vào giá. Kiểm tra chất lượng bản gel.
- Bước 4: Sau đó nhuộm với EtBr, SYBR gold hoặc làm khô gel.
3.3.11. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp Sắc ký ái lực
- Bước 1: Chọn dòng vi khuẩn đã biểu hiện thành công gen OsmC2.
- Bước 2: Bổ sung 1 mM (IPTG) khi nồng độ OD600 của môi trường nuôi đạt ~0.6 nuôi 37oC trong 4h để kích hoạt vùng operon của đoạn gen.
- Bước 3: Sau đó, li tâm dịch khuẩn ở 6000 vòng/phút trong 10 phút để thu tế bào.
- Bước 4: Tế bào thu lại được bổ sung dung dịch đệm (50 mM KH2PO4, 0,3 M KCl, and 5 mM imidazole, pH 8,0). Tế bào được phá vỡ bằng sóng siêu âm, sau được giữ nóng ở 70oC/20 phút.
- Bước 5: Dịch nổi được thu lại bằng ly tâm và nạp vào cột sắc ký ái lực IMAC NTA. OsmC2 được thu lại bằng dung dịch imidazole với các nồng độ khác nhau.
- Bước 6: Sau khi qua các bước ly trích và tinh sạch, sản phẩm đều được kiểm tra lại độ tinh sạc của protein nhờ kỹ thuật điện di trên gel SDS-PAGE 12,5% (Hames, 1998).
- Bước 7: Tất cả các bước đều được thực hiện ở 4°C để bảo vệ hoạt tính của enzyme.
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nghiên cứu khuếch đại OsmC2 từ vi khuẩn T.kodakarensis KDO1
4.1.1. Tách chiết DNA hệ gen của T.kodakarensis KOD1.
Kết quả DNA hệ gen của Thermococcus kodakarensis KDO1 được thể hiện đại diện trên hình 4.1.
Thermococcus kadakorensis KDO1 được nuôi trong môi trường NBRC 702. Ly tâm dịch nuôi ở 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu cặn tế bào. Sau đó, tách chiết ADN hệ gen bằng bộ kit do Promega cung cấp. Sau khi tách chiết ADN hệ gen, sản phẩm được kiểm tra bằng cách điện di qua gel agarose 1%. Kết quả điện di thể hiện trên hình 4.1 cho thấy, sau tách chiết thu được ADN hệ gen ở tình trạng ổn định không xuất hiện bị đứt gãy. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 4.1. Ảnh điện di ADN hệ gen được tách chiết từ Thermococcus kodakarensis KDO1
(Giếng M: Điểm đánh dấu; giếng 1: Mẫu DNA T.kodakarensis KDO1; giếng 2: Plasmid pET21b chứa OsmC2)
- Kết quả đánh giá độ tinh sạch của ADN hệ gen của Thermococcus kodakarensis KDO1 được thể hiện qua bảng 4.1.
Khi kiểm tra độ tinh sạch của mẫu ADN hệ gen bằng máy đo quang phổ cho nồng độ ADN lần lượt là 37,4; 38,9 và 36,8 ng/µl, trong khi đó tỉ số OD260/ OD280
tương ứng là 1,88; 1,96 và 1,82. Kết hợp dữ liệu này cùng với hình ảnh điện di trên gel agarose 1% (hình 4.1) cho thấy, ADN hệ gen được tách chiết từ Thermococcus kodakarensis KDO1 đủ điều kiện để sử dụng cho các nghiên cứu về khuếch đại gen tiếp theo.
Bảng 4.1. Kết quả đo độ tinh sạch và nồng độ ADN
OD 260 nm 280 nm 260 nm/280 nm (Mẫu 1: ADN hệ gen mẫu số 1; mẫu 2: ADN hệ gen mẫu số 2; mẫu 3: ADN
hệ gen mẫu số 3)
4.1.2. Khuếch đại gen mã hóa OsmC2 bằng phương pháp PCR
Kết quả khuếch đại gen mã hóa OsmC2 từ Thermococcus kodakarensis KDO1 thể hiện trên (hình 4.2). Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi FOS2 và ROS2 để khuếch đại đoạn gen mã hóa amidase ở vi khuẩn Thermococcus kodakarensis
KDO1. Sản phẩm PCR được thực điện di kiểm tra trên gel agarose 1% cho hình ảnh một bang vạch sáng. (giếng 1- Hình 4.2) tương đương với kích thước lý thuyết của đoạn gen OsmC2 (420bp). Phụ lục 1: Trình tự gen TK 2017.
Hình 4.2. Hình ảnh điện di đoạn gen OsmC2 được khuếch đại từ AND hệ gen.
(Giếng M: Lambda HindIII marker; Giếng 1: Sản phẩm PCR khuếch đại OsmC2)
- Kết quả tinh sạch đoạn gen mã hóa OsmC2 từ Thermococcus kodakarensis
KDO1 được khuếch đại.
Sau khi được khuếch đại thành công. Đoạn gen được tiến hành tinh sạch bằng bộ kit purification và điện di kiểm tra độ tinh sạch tra trên gel agarose 1%.
Kết quả trên hình 4.3 chỉ tồn tại bang vạch sáng duy nhất trên bản gel. (giếng 1 – Hình 4.3) điều này cho thấy, sau quá trình tinh sạch, sản phẩm PCR đã loại bỏ được toàn bộ tạp chất còn sót sau quá trình khuếch đại gen.
Hình 4.3. Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch.
(Giếng M: Lambda HindIII marker; giếng 1: Sản phẩm PCR khuếch đại OsmC2 đã tinh sạch.)
4.2. Nghiên cứu tạo dòng gen mã hóa protein OsmC2 từ T. kodakarensis KOD1
4.2.1. Gắn nối đoạn gen OsmC2 vào vector tạo dòng pGEM T-easy
Đoạn gen OsmC2 sau khi tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pGEM T- easy và ủ ở 25ºC trong 1 giờ. Sản phẩm gắn nối được biến nạp vào tế bào vi khuẩn
E.coli JM109. Khuẩn lạc chứa plasmid mang gen OsmC2 được chọn lọc trên môi trường LB có chứa kháng sinh ampicilin, cơ chất X-gal và chất cảm ứng IPTG. Sau khi nuôi ở điều kiện 37ºC, chọn các khuẩn lạc màu trắng và khuẩn lạc màu xanh ( đối chứng) được nuôi tăng sinh trong môi trường LB lỏng để tách chiết plasmid và kiểm tra kích thước vector.( hình 4.4). Những khuẩn lạc cho plasmid có kích thước lớn hơn so với đối chứng ( khuẩn lạc 3,4,6) tiếp tục được cắt bằng enzyme giới hạn NdeI và XhoI. Các khuẩn lạc lại chứa vector pGEM- OsmC2 và pET21b được nuôi cấy, tách chiết plasmid và cắt bằng enzyme NdeI và XhoI để phục vụ cho việc tạo vector biểu hiện pET21b-OsmC2. Như vậy đã tách dòng thành công gen OsmC2.
Hình 4.4. Hình ảnh điện di vector tạo dòng tách chiết.
(Giếng M: Điểm đánh dấu Lamda / Hindlll,Giếng 1: Plasmid pET21b ,Giếng 2-6: Plasmid tách chiết từ khuẩn lạc trắng.)
Những khuẩn lạc cho plasmid có kích thước lớn hơn so với đối chứng ( khuẩn lạc 3,4,6) tiếp tục được cắt bằng enzyme giới hạn NdeI và XhoI. Các khuẩn lạc lại chứa vector pGEM-OsmC2 và pET21b được nuôi cấy, tách chiết plasmid và cắt
bằng enzyme NdeI và XhoI để phục vụ cho việc tạo vector biểu hiện OsmC2- pET21b. Như vậy đã tách dòng thành công gen OsmC2.
4.2.2. Kiểm tra gắn nối bằng enzyme giới hạn
- Kết quả kiểm tra gắn nối bằng enzyme giới hạn NdeI và XhoI.
Sau khi chọn lọc được những dòng khuẩn lạc cho plasmid có kích thước lớn hơn so với đối chứng ( KLT số 1,2 ở giếng 4,5 – Hình 4.5), các plasmid này tiếp tục được chọn lọc bằng enzyme giới hạn NdeI và XhoI. Kết quả được thể hiện ở hình 4.5 cho thấy, các dòng khuẩn lạc số 1 và 2 (lần lượt là giếng 3,4) đều cho hai băng sáng ứng với kích thước lý thuyết lần lượt xấp xỉ là 3000 bp của PGEM T-easy . Như vậy đã tách dòng thành công đoạn gen OsmC2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 4.5. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt các dòng plasmid có khả năng mang gen OsmC2
(Giếng M: Lambda HindIII marker; Giếng 1: Plasmid tách chiết từ KLX; Giếng 2,3: Plasmid tách chiết bởi NdeI và XhoI; Giếng 4: Sản phẩm PCR khuếch đại
OsmC2 đã tinh sạch.)
4.3. Thiết kế và tạo vector biểu hiện protein OsmC2 từ Thermococcus kodakarensis KDO1
-Kết quả tách chiết vector biểu hiện
Để sử dụng hiệu quả vector thương mại pET21b nhằm mục đích biểu hiện gen OsmC2, chúng tôi kiểm tra bằng cách biến nạp vector biểu hiện pET21b (5369bp)
vào tế bào khả biến E. coli DH5α và cấy trải trên môi trường LB có bổ sung ampicillin. Sau khi nuôi qua đêm ở 37 oC, thu được hơn 300 khuẩn lạc. Chọn dòng khuẩn lạc nghi mang vector biểu hiện pET21b, nuôi tăng sinh trong LB lỏng để tách chiết plasmid và kiểm tra kích thước vector (giếng 1- Hình 4.6). Vector nghi tách thành công được tiến hành cắt mở vòng bằng XhoI và tiếp tục được điện di kiểm tra. (giếng 2 - Hình 4.6).
Kết quả cắt mở vòng cho thấy trên giếng 2 – Hình 4.6 xuất hiện một băng vạch duy nhất có kích thước xấp xỉ 5500 bp, đây là kích thước phù hợp với kích thước lý thuyết của vector pET21b là 5368 bp. Vì vậy, plasmid này đủ điều kiện để tiến hành