Tinh sạch protein chịu nhiệt OsmC2

Tế bào OsmC2 E. coli BL21 có chứa gen OsmC2 được nuôi cấy ở 37oC trên môi trường LB lỏng, tốc độ lắc 200v/p đến khi OD600 nm đạt 1,0. Bổ sung IPTG đạt nồng độ 1 mM và tiếp tục nuôi 4 tiếng để cảm ứng biểu hiện protein. Thu dịch protein tổng số và đun ở điều kiện 70oC trong 20 phút và cho nạp vào cột Ni-NTA để tinh sạch. Các phân đoạn rửa với các nồng độ imidazol khác nhau được sử dụng để thu protein và kiểm tra trên điện di SDS-PAGE. Kết quả thu được thể hiện trong (hình 4.10) cho thấy, protein thu được ở phân đoạn 30 mM imidazol có một băng duy nhất tương ứng với kích thước khoảng 32 kDa, tương đương kích thước protein OsmC2, các phân đoạn khác còn nhiều các băng protein khác. Như vậy, sử dụng cột Ni-NTA để tinh sạch protein OsmC2 sẽ cho protein có độ tinh sạch cao ở phân đoạn

30 mM imidazol, đáp ứng cho các yêu cầu nghiên cứu hoạt tính, tính chất về sau.

Hình ảnh 4.10. Tinh sạch protein OsmC2 bằng cột sắc kí Ni-NTA

(Giếng M: Marker protein tầm thấp M3913 Sigma; Giếng U: Protein thô từ dịch phá vỡ tế bào; 30, 50, 100, 250: Phân đoạn protein rửa bằng dung dịch Imidazol

Phần 5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

Chúng tôi đã thiết kế và khuếch đại thành công đoạn gen OsmC2 từ chủng

Thermococcus kodakarensis KOD1.

Đã tạo dòng thành công vector tạo dòng pGEM-OsmC2 và vetor biểu hiện pET28-OsmC2.

Nghiên cứu đã biểu hiện thành công protein chịu nhiệt OsmC2 trong tế bào

E.coli BL21 DE3.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tinh sạch OsmC2 bằng cột sắc kí Ni-NTA.

5.2. Kiến nghị

- Tiến hành biểu hiện với lượng lớn tinh sạch protein và nghiên cứu phân tích các hoạt tính.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt

1. Nguyễn Văn Cách, (2005) Giáo trình tin sinh, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.

2. Nguyễn Hoàng Lộc, Triệu Thị Lệ, Hà Thị Minh,(2007) Giáo trình sinh học phân tử, nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.

3. Hồ Thị Tuyết Mai, Bài giảng Công nghệ Enzyme, (2006) Trường CĐ Lương Thực Thực Phẩm Đà Nẵng.

4. Trần Xuân Ngạch, Công Nghệ Enzyme, (2007) Nhà xuất bản Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng.

5. Lương Đức Phẩm, Công nghệ vi sinh vật, (2004) Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội.

Tiếng Anh

6. Pham, B.P, Jia, B, Lee, S, Ying, S, Kwak, J.M, Cheong, G.-W, Chaperone-like activity of a bacterioferritin comigratory protein from Thermococcus kodakaraensis KOD1 (2015), Protein and Peptide Letters 22 (5), Pages 443-448.

7. Cui, Z., Wang, Y., Pham, B.P., Ping, F., Pan, H., Cheong, G.-W., Zhang, S., Jia, B. High level expression and characterization of a thermostable lysophospholipase from Thermococcus kodakarensis KOD1 (2012) Extremophiles, 16 (4), pp. 619- 625.

8. C. Schiraldi, M. Giuliano, M. De Rosa, Perspectives on biotechnological applications of archaea, Archaea 1 (2002), tr 75–86.

9. C. Gutierrez, J.C. Devedjian, “Osmotic induction of gene osmC expression in Escherichia coli K12”, J. Mol. Biol. 20 (1991) 959–973.

10. U. Völker, K.K. Andersen, H. Antelmann, K.M. Devine, M. Hecker, “One of two OsmC homologs in Bacillus subtilis is part of the σB-dependent general stress regulon”, J. Bacteriol. 180 (1998) 4212–4218.

11. Atomi, H., et al., “Description of Thermococcus kodakaraensis sp. nov., a well studied hyperthermophilic archaeon previously reported as Pyrococcus sp. KOD1”. Archaea, 2004. 1(4): p. 263-7.

12. Fukui, T., et al (2011), “Complete genome sequence of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1 and comparison with

Pyrococcus genomes”. Genome Res115(3): p. 352-63.

13. Jia, B., Lee, S., Pham, B.P., Kwack, J.M., Jin, H., Li, J., Wang, Y., Cheong, G.- W. “Biochemical characterization of deblocking aminopeptidases from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakarensis KOD1”, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 75 (6), pp. 1160-1166.

14. Ruan, J., “Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (second edition) Volume 5 and the study of Actinomycetes systematic in China”. Wei Sheng Wu Xue Bao, 53(6): p. 521-30.

15. Macalady, J.L., et al.(2004), “Tetraether-linked membrane monolayers in Ferroplasma spp: a key to survival in acid. Extremophiles,. 8(5): p. 411-9.

16. Fiala, J., “The Scientific Council of the Czech Ministry of Health and its function”. Cesk Pediatr, 1986. 41(7): p. 418-9.

17. Li, J.F., “ A fast neighbor joining method. Genet Mol Res”, 2015. 14(3): p. 8733-43.

18. Escriva, H., et al.(1995), “Rat mammary-gland transferrin: nucleotide sequence, phylogenetic analysis and glycan structure”. Biochem J, 307 (Pt 1): p. 47-55.

19. Miroshnichenko, V.P., et al.(1989), “Characteristics of the diagnosis and treatment of severe forms of late pregnancy toxemia”. Akush Ginekol (Mosk), (5): p. 43-8.

20. Zheng, X., et al.(2014), “Phylogeny and evolutionary histories of Pyrus L. revealed by phylogenetic trees and networks based on data from multiple DNA sequences”. Mol Phylogenet Evol, 80: p. 54-65.

21. Ishino, Y. and I.K. Cann(1998), “The euryarchaeotes, a subdomain of Archaea, survive on a single DNA polymerase: fact or farce”, Genes Genet Syst, 73(6): p.323-36.

22. Woese, C.R. and R. Gupta (1981), “Are archaebacteria merely derived 'prokaryotes” Nature, 289(5793): p. 95-6.

23. Gupta, R.S.(2002), “The natural evolutionary relationships among prokaryotes”. Crit Rev Microbiol, 26(2): p. 111-31.

24. Gribaldo, S. and C. Brochier-Armanet(2006), “The origin and evolution of Archaea: a state of the ar”t. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2006. 361(1470): p. 1007-22

25. Vannier, P., et al.(2015), “Genome expression of Thermococcus barophilus and

Thermococcus kodakarensis in response to different hydrostatic pressure conditions”. Res Microbiol, 166(9): p. 717-25.

26. Lamosa, P., et al.(1998), “Effects of temperature, salinity, and medium composition on compatible solute accumulation by thermococcus spp”. Appl Environ Microbiol, 64(10): p. 3591-8.

27. Baneyx, F. (1999). "Recombinant protein expression in Escherichia coli"

Curr Opin Biotechnol, 10(5), 411-421.

28. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. (1989), “Molecular Cloning-A Laboratory Manual”, Cold Spring Habor Laboratory, USA.

29. Mbuyi, J. M., J. Dequeker, F. Bloemmen, E. Stevens (1982). "Plasma proteins in human cortical bone: enrichment of alpha 2 HS-glycoprotein, alpha 1 acid-glycoprotein, and IgE", Calcif Tissue Int, 34(3), pg. 229-231.

30. Novagen (2006). "pET System Manual" TB055 11th Edition, Rev.B, 0403, USA.

31. Sugantha priya S, Gowri Shankar J, Thirumalaisamy R, K. P (2010). "Over Expression of IPTG inducible GST protein in E. coli BL21.", Journal of Biomedical Sciences and Research, 2(1), pg. 54-59.

32. The QIAexpressionistTM (2003), “A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins”, Fifth edition, QIAGEN, Germany.

33. Zhang, J., et al. (2015), “Analysis of chromosome 22q11 copy number variations by multiplex ligation-dependent probe amplification for prenatal diagnosis of congenital heart defect”. Mol Cytogenet, (8): p. 100.

34. Fukui T, Atomi H, Kanai T, Matsumi R, Fujiwara S, Imanaka T. Complete genome sequence of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1 and comparison with Pyrococcus genomes. Genome Res. 2005 Mar;15(3):352-63.

35. T. de Miguel Bouzas, J. Barros-Velazquez, T.G. Villa, Industrial appli- cations of hyperthermophilic enzymes: a review, Protein Pept. Lett. 13 (2006) 645–651.

36. D.A. Cowan, Enzymes from thermophilic archaebacteria: current and future applications in biotechnology, Biochem. Soc. Symp. 58 (1992) 149–169.

37. C. Schiraldi, M. Giuliano, M. De Rosa, Perspectives on biotechnological applications of archaea, Archaea 1 (2002) 75–86.

38. C. Gutierrez, J.C. Devedjian, Osmotic induction of gene osmC expression in Escherichia coli K12, J. Mol. Biol. 20 (1991) 959–973.

39. U. Völker, K.K. Andersen, H. Antelmann, K.M. Devine, M. Hecker, One of two OsmC homologs in Bacillus subtilis is part of the σB-dependent general stress regulon, J. Bacteriol. 180 (1998) 4212–4218.

40. M. Davalos-Garcia, A. Conter, I. Toesca, C. Gutierrez, K. Cam, Regulation of osmC gene expression by the two-component system rcsB–rcsC in Escherichia coli, J.Bacteriol. 183 (2001) 5870-5876.