Cỏc tế bào cõy bị tổn thƣơng sẽ tiết ra cỏc hợp chất húa học dẫn dụ vi khuẩn nhƣ: Acetosyringon, Hydroxy-acetosyringon... Dƣới tỏc dụng của cỏc hợp chất này,
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
A. tumefaciens nhận biết rồi bỏm vào thành tế bào chủ và chuyển T - DNA vào tế bào thực vật. Quỏ trỡnh này đƣợc sự trợ giỳp đặc biệt của cỏc gen Vir và RB, LB
[8]. Cũng chớnh cỏc hợp chất này, với vai trũ cảm ứng, giỳp cho cỏc gen vựng Vir
hoạt động và tăng cƣờng biểu hiện.
Hoạt động của cỏc gen Vir sinh ra sợi đơn T - DNA làm xuất hiện bản sao sợi bờn dƣới của T - DNA. Chỉ đoạn sợi đơn DNA giữa hai trỡnh tự biờn (LB và RB) của T - DNA mới đƣợc chuyển vào tế bào thực vật, và đƣợc gắn vào hệ gen của tế bào. Đú là yếu tố hoạt động cis của hệ thống vận chuyển T - DNA. Protein
Vir D1, D2 đúng vai trũ là chỡa khúa trong bƣớc này, chỳng nhận ra trỡnh tự biờn T - DNA và cắt sợi bờn dƣới tại mỗi bờn. Điểm cắt là điểm đầu và kết thỳc của sợi tỏi sinh. Sau đú, protein Vir D2 vẫn cũn gắn kết với đầu cuối 5’ của sợi T - DNA và tế bào thực vật. Nếu gõy đột biến hay loại bỏ đọan RB thỡ hầu nhƣ mất hoàn toàn khả năng chuyển T - DNA, cũn nếu đột biến LB sẽ làm giảm hiệu quả chuyển T - DNA (Hill J. và cs., 1983). Điều đú chứng tỏ tổng hợp sợi T - DNA là từ đầu 5’đến 3’, đƣợc bắt đầu từ đoạn RB và kết thỳc ở LB.
Sau khi T - DNA qua màng tế bào chỳng đi thẳng vào nhõn và kết hợp với hệ gen thực vật, bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opin gõy nờn sự phỏt triển thỏi quỏ của hàng loạt tế bào lõn cận dẫn đến sự hỡnh thành khối u Hỡnh 1. 4 [37].
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
1.4.5 Tương tỏc giữa T - DNA và genome tế bào thực vật
Trong tế bào thực vật, phức ss-T - DNA đƣợc đƣa qua màng nhõn vào nhõn. Hai protein đúng vai trũ quan trọng trong bƣớc này là Vir D2 và Vir E2. Tớn hiệu định vị trong nhõn của Vir D2 và Vir E2 đúng vai trũ chủ yếu. Protein Vir D2 cú
chức năng xỏc định vị trớ cho T - DNA trong nhõn. Phức ss - T - DNA là phức nucleoprotein lờn đến 20 kb chứa một đầu 5’ gắn với protein Vir D2. Nhƣng phức đƣợc bao bọc bởi số lƣợng lớn phõn tử Vir E2 (xấp xỉ 600/ 20 kb T - DNA) và mỗi phức này cú hai tớn hiệu định vị trong nhõn. Hai tớn hiệu này của Vir E2 đúng vai trũ quan trọng đối với việc nhận liờn tục phức T - DNA của nhõn, cú khả năng kớch thớch mở lỗ màng nhõn. Khả năng nhận phức của nhõn đƣợc điều khiển bởi protein kết hợp tớn hiệu định vị đặc trƣng trong nhõn, protein đƣợc tỡm thấy trong tế bào chất của tế bào thực vật [34].
Bƣớc cuối cựng trong quỏ trỡnh vận chuyển T - DNA là sự tƣơng tỏc trong genom tế bào thực vật. Cỏc phản ứng trong sự tƣơng tỏc T - DNA khụng cú tớnh điển hỡnh. Sự tƣơng tỏc này tỡm thấy bởi sự tỏi tổ hợp khụng theo quy luật. Theo cỏch nhỡn nhận việc cắt bỏ bớt base, nhƣ microhomologies, đƣợc cần đến đối với bƣớc lặp lại giữa cặp vận chuyển T - DNA với Vir D2 và DNA thực vật. Sự tƣơng đồng này rất thấp và cung cấp đặc trƣng nhỏ nhất đối với quỏ trỡnh tỏi tổ hợp bởi sự xỏc định vị trớ của Vir D2 để gắn kết. Ở trỡnh tự gần kề hay đầu 3’ của T - DNA tỡm thấy một vài sự tƣơng đồng nhỏ với DNA thực vật, kết quả ở sự tƣơng tỏc đầu tiờn giữa sợi T - DNA và DNA thực vật là tạo lỗ hổng ở sợi 3’-5’ của DNA thực vật. Sau đú DNA thực vật đƣợc cắt ở vị trớ đầu 3’ của lỗ hổng bởi endonuclease và nucleotit của đầu 5’ bắt cặp với Vir D2 bởi một nucleotit của đầu 5’ bắt cặp với Vir D2 bởi một nucleotit trong đầu sợi (5’ - 3’) DNA thực vật. Phần 3’ nhụ ra của T - DNA cũng nhƣ DNA thực vật thay thế bị phõn hủy bởi endonuclease hay 3’- 5’ enxonuclease. Đầu 5’ của T - DNA gắn với Vir D2 cũn đầu 3’ kia cặp đụi với DNA thực vật kộo dài từ bƣớc đầu của quỏ trỡnh tƣơng tỏc, nối liền với vết cắt trong sợi DNA dƣới của thực vật. Sự đƣa vào của sợi T- DNA trong sợi 3’ - 5’ của DNA thực vật đƣợc bổ sung, tỡnh trạng xoắn sinh ra bởi vết cắt trong sợi đối ngƣợc đƣợc sản sinh.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tỡnh trạng này hoạt húa phản ứng sửa chữa của tế bào thực vật và sợi bổ sung đƣợc tổng hợp sử dụng để chốn dễ dàng sợi T - DNA nhƣ là sợi khuụn. Vir D2 cú vai trũ hoạt húa trong sự hũa hợp chớnh xỏc sợi T - DNA vào nhiễm sắc thể thực vật. Phúng thớch protein Vir D2 cú thể cung cấp năng lƣợng chứa đựng trong cỏc liờn kết phosphodieste, nhƣ Tyr 29 với nucleotit đầu tiờn của sợi T - DNA, qui định đầu 5’ của sợi T - DNA khụng cũn. Ngoài ra, quỏ trỡnh chuyển T - DNA cũn cú sự tƣơng tỏc với cỏc protein do gen trờn nhiễm sắc thể của A. tumefaciens quy định và protein trong tế bào thực vật [37].
1.4.6 Một số phương phỏp biến nạp gen thụng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Kể từ khi vai trũ của A. tumefaciens đƣợc phỏt hiện và nghiờn cứu thỡ chỳng đó trở thành cụng cụ chuyển gen hữu hiệu vào thực vật. Phƣơng phỏp biếnnạp gen thụng qua vi khuẩn A. tumefaciens gồm cú 2 hệ thống chớnh.
1.4.6.1 Hệ thống chuyển gen in vitro
Khú khăn chớnh trong việc xõy dựng hệ thống chuyển gen in vitro là phải cú đƣợc sự kết hợp giữa sự xõm nhiễm của A. tumefaciens và khả năng tỏi sinh của cỏc tế bào sau khi lõy nhiễm với vi khuẩn [19].
Một số trợ giỳp kỹ thuật trong quỏ trỡnh biến nạp đó cải thiện hiệu quả của hệ thống chuyển gen in vitro nhờ A. tumefaciens bao gồm:
Xử lý súng siờu õm
Xử lý một thực vật với A. tumefaciens trong điều kiện súng siờu õm tạo ra cỏc tổn thƣơng nhỏ, đồng nhất ở mụ thực vật, cho phộp vi khuẩn A. tumefaciens dễ dàng xõm nhập vào tế bào thực vật. Bằng phƣơng phỏp này đó cải thiện rừ rệt hiệu quả chuyển gen, biểu hiện gus tạm thời đó tăng từ 100 lờn 1400 lần ở cỏc tế bào đậu tƣơng, đậu đũa, lỳa mỳ và ngụ [67].
Ly tõm tế bào
Phƣơng phỏp chuyển gen thụng qua A. tumefaciens kết hợp với ly tõm đó đƣợc ỏp dụng thành cụng khi biến nạp vào huyền phự tế bào phụi húa nhận đƣợc từ
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
hoa chuối đực nuụi cấy in vitro của hai giống chuối thƣơng mại Cavendish và Lady Finger. Tần số chuyển gen đó đƣợc cải thiện đỏng kể bằng cỏch ỏp dụng chế độ ly tõm tế bào thực vật trong quỏ trỡnh nuụi cấy cộng sinh với vi khuẩn [40].
1.4.6.2 Hệ thống chuyển gen in vivo
Phƣơng phỏp này dựa trờn cơ sở của việc chuyển gen vào nguyờn cõy (in planta) và rất phổ biến đối với loài A. thaliana, một trong những loài cõy mụ hỡnh đối với cỏc nghiờn cứu về di truyền học. Phƣơng phỏp chuyển gen này tốn ớt thời gian, bỏ qua cụng đoạn nuụi cấy mụ và tỏi sinh sau biến nạp, vỡ thế loại bỏ đƣợc cỏc biến dị soma và số lƣợng cõy chuyển gen thu đƣợc lớn hơn. Kỹ thuật này đó đƣợc mụ tả ở cỏc cõy trồng khỏc nhau nhƣ đậu tƣơng, Arabidopsis, hoa hƣớng dƣơng và cõy lạc. Hệ thống chuyển gen in vivo sử dụng một số phƣơng phỏp sau [40]:
Phương phỏp chuyển gen vào hạt Phương phỏp ngõm cụm hoa Phương phỏp thấm lọc chõn khụng
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1. Nguyờn liệu
Nguyờn liệu thực vật
Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi đó sử dụng giống ngụ Q411 do Viện Nghiờn cứu Ngụ cung cấp, đƣợc gieo trong phũng thớ nghiệm để lấy mầm làm nguyờn liệu tỏch DNA tổng số.
Mẫu nghiờn cứu
- Cỏc chủng vi sinh vật, plasmid
+ Chủng E.coli DH5α và chủng A. tumefaciens C58 (pGV2260)
+ Plasmid
- Vector tỏch dũng: pJET1.2/blunt (Fermentas).
- Vector tỏi tổ hợp pRTRA7/3 mang gen cryIA(c) d-ới sự điều khiển của đoạn
khởi động 35S promoter do Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học thiết kế.
Cặp mồi
Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi đó sử dụng 2 cặp mồi để phõn lập và chọn dũng gen Bảng 2. Bảng 2.1. Cỏc cặp mồi đƣợc sử dụng STT Tờn primer Trỡnh tự nucleotide 1 Sus F2 5’- GGGGCATACCGCAAAACCAG -3’ Sus R 5’- CAAGGAAACGCAACGCAGTG -3’ 2 Zsuc-PstIF 5’- GCGCGCCTGCAGGGGCATACCGCAAAACCAG -3’ Pst I
Zsuc-NcoIR 5’- GCGCGCCCATGGTCCAAGGAAACGCAACGCAGTG- 3’
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Húa chất
Cỏc húa chất đƣợc sử dụng cho cụng việc nghiờn cứu đƣợc mua của cỏc hóng khỏc nhau và đƣợc đƣa ra ở Bảng 2.2:
Bảng 2.2. Cỏc húa chất sử dụng
Tờn húa chất Cỏc hóng cung cấp
Agarose Gibco BRL Life technology
Agar agar Merk
Glucose Merk
Marker DNA 1kb Fermentas
Húa chất tinh sạch sản phẩm PCR Promega
BigDyeđ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Appied Biosystems
CloneJETTM PCR Cloning Kit Fermentas
Penicilline In vitro gen
Glycerol Merk
Cỏc mụi trƣờng và dung dịch sử dụng
- Mụi trƣờng nuụi cấy vi sinh vật:
+ Mụi trường LB lỏng: Hỗn hợp Lucia Bertani bao gồm Bacto -Tryptone 10 g/l; Yeast extract 5 g/l; NaCl 10 g/l; NaOH 2 mM.
+ Mụi trường LB đặc: Bao gồm mụi trƣờng LB lỏng bổ sung thờm Bacto - Agar 15 g/l.
-Cỏc dung dịch tỏch DNA plasmid:
+ Dung dịch I: Glucose 50mM; Tris - Cl 25 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM, pH 8,0.
+ Dung dịch II: NaOH 0,2 M; SDS 1%.
+ Dung dịch III: CH3COOK 3 M; CH3COOH 5 M. - Dung dịch dựng để chạy điện di DNA trờn gel agarose:
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn + Dung dịch đệm TAE 50X (100 ml): Tris Base 1M 24,4 g CH3COOH 3M 5,62 ml EDTA 0,5M pH8,0 10 ml + Loading dye (6X): Bromophenol blue 0,25% Xylen cyanol FF 0,25% Glycerol 30%
+ Dung dịch nhuộm gel: ethidium bromide (EtBr) 0,5 àg/ml.
Cỏc enzyme Tờn enzyme Hóng cung cấp Xbal Fermentas XhoI Fermentas NoI Fermentas PstI Fermentas BamHI Fermentas HinDIII Fermentas
T4 DNA ligase Fermentas
Ribonuclease Sigma
Taq DNA polymerase Fermentas
Trang thiết bị
Trong quỏ trỡnh nghiờn cứu, chỳng tụi đó sử dụng cỏc trang thiết bị nhƣ nờu dƣới đõy
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.3. Trang thiết bị dựng trong nghiờn cứu
Tờn trang thiết bị Cụng ty, hóng sản xuất
Tủ lạnh -200C, -800C Sanyo
Lũ vi súng Samsung
Mỏy chụp ảnh Gel-Doc Applied BioSciences
Mỏy ly tõm 5415 R (Centrifuge) Eppendorf
Mỏy PCR (GeneAmp PCR System 9700) Appied Biosystems
Mỏy xỏc định trỡnh tự ABI PRISM 3100-Avant
Genetic Analyzer Appied Biosystems
Bể ổn nhiệt Tempette Junior Techne
Vortex OSI Rotolab
Mỏy lắc (Shaking Incubator ) Gyromax 737R Amerex
Instrument
Pippetman Glison
Cõn phõn tớch (Analytic balances) Mettler Toledo
Cõn điện tử (Electronic balances) Ohaus
Mỏy làm khụ chõn khụng (Speed Vacuum Sc 110A) Savant Mỏy soi DNA (Mini trans-illuminator) Bio - Rad Mỏy đo pH (Digital pH Meter Delta 320) Mettler Toledo
Tủ nuụi 370C BINDER
Tủ nuụi lắc 370
C INFORS
Box nuụi cấy vi khuẩn NUAIRE
Box nuụi cấy tế bào động vật BIOQUELL
Tủ nuụi CO2 Sanyo
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.1. Phương phỏp tỏch chiết DNA tổng số mầm ngụ
Nguyờn tắc
Thành tế bào thực vật đƣợc phỏ vỡ bằng cỏc biện phỏp cơ học kết hợp với việc sử dụng cỏc chất tẩy rửa mạnh. DNA đƣợc giải phúng và làm sạch tạp chất nhờ
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
proteinase K, dung dịch Chloroform – Isoamyl Alcohol (24:1). DNA đƣợc kết tủa trong cồn tuyệt đối ở - 20o
C và thu tủa nhờ li tõm.
Quy trỡnh
DNA tổng số đƣợc tỏch chiết theo phƣơng phỏp của Becker và đtg [15], nhƣng cú cải tiến cho phự hợp với mụ mầm ngụ, bao gồm cỏc bƣớc sau:
- Nghiền 2g mầm ngụ bằng cối chày sứ (cối, chày sứ phải vụ trựng và đƣợc giữ lạnh ở - 70oC) trong Nito lỏng cho đến khi thành dạng bột mịn.
- Hũa tan mẫu trong 5ml dung dịch đệm chiết cú thành phần: 0,1M NaCl; 10 mM Tris – HCl pH 8,0; 10mM EDTA pH 8,0; 2% SDS.
- Dịch mẫu đƣợc ủ ở 56oC trong 2 giờ, tiến hành đảo đều ống trong quỏ trỡnh ủ. - Thờm 1ml NaCl 6M, để 45 phỳt ở nhiệt độ phũng. Ly tõm mẫu ở 14.000v/p
ở 4oC, Thu dịch ở pha trờn.
- Bổ sung một thể tớch tƣơng ứng dung dịch 25: 24: 1, đảo đều và ly tõm ở 14000v/p trong 15 phỳt.
- Chuyển dịch pha trờn sang ống mới.
- Tiếp tục bổ sung thể tớch tƣơng ứng dung dịch 24 : 1 vào ống, đảo đều ống, ly tõm 14000v/p.
- Chuyển dịch pha trờn sang ống mới.
- Tủa DNA bằng cồn 100% trong 3 giờ ở - 20o C.
- Ly tõm 14.000v/p trong 15 phỳt ở 4oC loại bỏ dịch, thu tủa.
- Rửa kết tủa bằng cồn 70%. Ly tõm 14.000v/p trong 15 phỳt ở 4oC, thu kết tủa. - Làm khụ mẫu và hũa tan DNA trong nƣớc khử ion vụ trựng
- Loại RNA: Bổ sung Rnase vào mẫu DNA thu đƣợc để đạt đến nồng độ cuối cựng là 100àg/ml, ủ mẫu ở 37oC.
2.2.2. Phương phỏp điện di DNA trờn gel agarose
Sản phẩm DNA (tỏch chiết từ E.coli, mụ, từ phản ứng PCR…) đƣợc phõn tớch định tớnh nhờ phƣơng phỏp điện di trờn gel agarose. Agarose là một loại polymer tỏch từ rong biển, cấu tạo của chỳng gồm 2 monomer là D - galactose và 3,6 - anhydro L - galactose [60].
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Nguyờn tắc:
DNA là cỏc đại phõn tử tớch điện õm nờn khi chịu tỏc động của một điện trƣờng cú hiệu điện thế và cƣờng độ dũng điện thớch hợp, chỳng sẽ di chuyển từ cực õm về cực dƣơng của điện trƣờng với tốc độ tỷ lệ nghịch với kớch thƣớc đoạn DNA. Từ đú mà DNA đƣợc tỏch thành cỏc vạch khỏc nhau trờn bản gel.
Nồng độ gel tựy thuộc vào kớch thƣớc trung bỡnh của cỏc đoạn DNA cần phõn tỏch. Đoạn DNA cú kớch thƣớc càng nhỏ đũi hỏi hàm lƣợng gel agarose càng lớn và ngƣợc lại. Bảng 2.4 cho thấy mối tƣơng quan giữa nồng độ agarose cần sử dụng để phõn tỏch cỏc trỡnh tự DNA cú kớch thƣớc xỏc định [60].
Bảng 2.4. Tƣơng quan giữa nộng độ gel agarose và kớch thƣớc đoạn DNA cần phõn tỏch
Hàm lƣợng agarose trong gel (%w/v) Kớch thƣớc cỏc đoạn DNA cần phõn tỏch (kb) 0,3 5 – 60 0,6 1 – 20 0,7 0,8 – 10 0,9 0,5 – 7 1,2 0,4 – 6 1,5 0,2 – 3 2,0 0,1 – 2
Sau khi điện di xong, bản gel đƣợc nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (EtBr) trong khoảng 10 phỳt. Cỏc phõn tử EtBr cú khả năng gắn xen giữa cỏc bazơ của DNA và phỏt huỳnh quang dƣới tỏch dụng của tia UV, do đú cỏc đoạn DNA sẽ đƣợc biểu hiện thành vạch đỏ da cam dƣới ỏnh sỏng đốn UV. Để ƣớc lƣợng kớch thƣớc cỏc trỡnh tự DNA trong gel agarose ngƣời ta dựng yếu tố đỏnh dấu trọng lƣợng phõn tử (molecular weight marker – MWM) là một tập hợp nhiều trỡnh tự DNA cú kớch thƣớc đó biết (Marker DNA).
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Cỏc bƣớc tiến hành:
- Chuẩn bị gel agarose 0,8%: Cho 0,8g agarose vào 100 ml đệm TAE 1X, đun trong lũ vi súng cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để nguội đến khoảng 60o
C thỡ đổ dung dịch agarose vào bản khuụn gel điện di đó cài lƣợc sẵn. Chiều dày gel khoản 50 mm là thớch hợp. Sau 30 - 40 phỳt khi agarose đó đƣợc polymer húa hoàn