Chƣơng 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.3. PCR (Polymerase chain reaction)
Là phƣơng phỏp tổng hợp lƣợng lớn ADN in vitro trờn cơ sở mẫu khuụn. Quỏ trỡnh tổng hợp DNA kộo dài mồi dựa trờn nguyờn tắc bắt cặp đặc hiệu của cỏc đoạn DNA cú trỡnh tự bổ sung và khả năng kộo dài chuỗi của enzyme bền nhiệt (phổ biến là Taq polymerase – phõn lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus). PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ cú ba bƣớc: biến tớnh, gắn mồi, kộo dài chuỗi. Kết quả, sau khoảng 2 - 3 giờ, lƣợng ADN sẽ khuếch đại lờn khoảng 200 – 500 lần.
PCR tự mồi: Là một trong cỏc kỹ thuật phỏt triển từ PCR. Đõy là phản ứng sử dụng cặp mồi dài cú trỡnh tự DNA gối lờn nhau để tiến hành tổng hợp kộo dài về hai phớa của mồi. Giai đoạn gắn mồi trong phản ứng này đƣợc tiến hành ở nhiệt độ thấp
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
nhằm tạo điều kiện cho cặp mồi bắt cặp chộo với nhau và kộo dài. Sự bắt cặp chộo tƣơng đồng và kộo dài của cỏc đoạn đƣợc tiếp tục diễn ra ở cỏc chu kỳ sau: Sản phẩm của lần PCR tự mồi này đƣợc dựng làm khuụn cho phản ứng PCR tiếp theo nhằm tăng số bản sao mong muốn. Toàn bộ quỏ trỡnh cú thể lặp lại cho đến khi đạt đƣợc kết quả tốt nhất.
Thành phần phản ứng:
Một mẫu phản ứng PCR đƣợc tiến hành trong tổng thể tớch 25àl gồm cỏc thành phần nhƣ sau:
Nhõn gen bằng kỹ thuật PCR sử dụng khuụn là sản phẩm của phản ứng của phản ứng PCR. Giai đoạn này gồm 30 chu kỳ trải qua cỏc bƣớc sau:
Bƣớc 1: Biến tớnh sợi DNA khuụn ở 940
C trong 4 phỳt (cắt đức liờn kết hydro làm ruỗi hai mạch kộp).
Bƣớc 2: Biến tớnh DNA, tỏch thành hai sợi đơn ở 940C trong 30 giõy. Bƣớc 3: Gắn mồi trờn sợi khuụn ở 640C trong 40 giõy
Bƣớc 4: Tổng hợp, kộo dài chuỗi ở 720
C trong 30 giõy. Bƣớc 5: Lặp lại 30 lần từ bƣớc 2 - 4. Phản ứng kết thỳc ở 720 C trong 7 phỳt và ủ mẫu ở 40 C. 2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế Cơ sở lý thuyết
Sử dụng cỏc enzyme hạn chế cắt phõn tử DNA thành hai mảnh dạng đầu bằng hay đầu dớnh tại cỏc vị trớ xỏc định nhờ trỡnh tự nhận biết đặc hiệu.
Quy trỡnh
Một phản ứng cắt của enzyme hạn chế thƣờng đƣợc tiến hành trong
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Thành phần Thể tớch (àl) H2O 6,5 Đệm 10X của enzyme 1,0 DNA plasmid 0,5àg/àl 2,0 Enzyme hạn chế 1U/àl 0,5
Hỗn hợp phản ứng cắt đƣợc trộn đều, ủ ở 370C với thời gian thớch hợp tựy từng loại enzyme. Sản phẩm phản ứng cắt đƣợc kiểm tra bằng cỏch điện di trờn gel agarose 0,8%.
2.2.5. Phản ứng nối ghộp gen
Cơ sở lý thuyết
Dƣới sự xỳc tỏc của enzyme T4 DNA ligase, cỏc cầu nối phosphodieste đƣợc hỡnh thành giữa hai nucleotide sỏt cạnh nhau trờn cựng một mạch (gốc phosphate đầu 5’ của nucleotide đoạn DNA này với gốc hydroxyl đầu 3’ của nucleotide của đoạn DNA kia), đồng thời giải phúng một phõn tử nƣớc.
Quy trỡnh
Thành phần của một phản ứng ghộp nối (10 àl):
Thành phần Thể tớch (àl)
T4 DNA ligase buffer 10X 1
Sản phẩm PCR 4
DNA plasmid 1àg/àl 1
T4 DNA ligase 5U/àl 1
H2O 5
Tổng 10
Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 160C trong khoảng 3 giờ.
2.2.6. Biến nạp plasmid
Cơ sở lý thuyết
Dƣới tỏc dụng của CaCl2 0,1 M, thành tế bào vi khuẩn E.coli đang ở giai đoạn sinh trƣởng trở nờn xốp, tạo điều kiện cho DNA cú thể chui qua cỏc lỗ xốp trờn màng tế bào chất khi thay đổi nhiệt độ đột ngột.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Quy trỡnh
- Tạo tế bào khả biến:
+ Cấy chuyển một khuẩn lạc E. coli DH5α trong 5 ml mụi trƣờng LB lỏng, lắc 200 vũng/phỳt ở 370C qua đờm.
+ Chuyển 0,5 ml dịch nuụi tế bào qua đờm sang 50 ml mụi trƣờng LB lỏng (pha loóng 100 lần dung dịch tế bào ban đầu), tiếp tục nuụi lắc ở 200 vũng/phỳt, 370C đến khi OD600 nm đạt 0,4 - 0,6. Dịch nuụi cấy sau khi chuyển sang ống ly tõm đƣợc để trong đỏ 20 phỳt.
+ Ly tõm 4000 vũng/phỳt ở 40C trong 10 phỳt, loại bỏ dịch, thu cặn tế bào. + Tế bào sau khi ly tõm đƣợc hũa trong 50 ml CaCl2 0,1 M lạnh. Ủ 35 phỳt ở 00C, ly tõm 4000 vũng/phỳt ở 40
C trong 10 phỳt để thu tế bào. + Hoà tan tế bào vào 25 ml CaCl2 0,1M lạnh. Ủ 25 phỳt ở 00
C, ly tõm 4000 vũng/phỳt ở 40C trong 10 phỳt để thu tủa tế bào.
+ Hũa tế bào vào 1200 àl (800 àl CaCl2 0,1 M và 400 àl Glycerol 60%). + Chia vào cỏc ống eppendorf 1,5 ml, mỗi ống 80 àl dịch tế bào và bảo quản ở - 800
C.
- Biến nạp:
+ Tế bào khả biến đƣợc lấy ra từ - 800C và đƣợc làm tan trờn đỏ trong 30 phỳt (trỏnh sốc nhiệt).
+ Bổ sung vào mỗi ống tế bào khả biến 4 àl mẫu sản phẩm lai (DNA + vector + T4DNA ligase), đảo nhẹ nhàng để DNA phõn bố đều trong dịch tế bào khả biến. Sau đú, đặt toàn bộ trờn đỏ trong thời gian 15 phỳt.
+ Sốc nhiệt: Mẫu đang đặt trờn đỏ đƣợc chuyển ngay sang bể ổn nhiệt cú nhiệt độ 420
C trong 70 - 90 giõy. Sau đú mẫu đƣợc lấy ra và đặt ngay lờn đỏ lạnh trong thời gian 5 phỳt. Bổ sung 0,3 ml LB lỏng, lắc hỗn hợp tế bào ở 370C trong 60 phỳt.
+ Hỳt 200 àl dịch tế bào và cấy trải trờn đĩa mụi trƣờng LB đặc cú chứa khỏng sinh Ampicilin 50 àg/ml. Ủ đĩa ở 370
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.7. Tỏch chiết DNA plasmid
Cơ chế lý thuyết
Phƣơng phỏp tỏch chiết DNA plasmid dựa trờn nguyờn lý sử dụng cỏc húa chất (SDS, NaOH) cú tỏc dụng phỏ vỡ cấu trỳc thành tế bào vi khuẩn, biến tớnh cỏc phõn tử protein và giải phúng cỏc plasmid của vi khuẩn. Khi thay đổi giỏ trị pH của dịch chiết tế bào bằng dung dịch cú chứa kali acetat, cỏc phõn tử protein và DNA hệ gen sẽ bị tủa, tỏch ra khỏi dung dịch bằng ly tõm tốc độ cao. RNA đƣợc loại bỏ bằng cỏch bổ sung RNase.
Quy trỡnh
- Cấy chuyển 1 khuẩn lạc của tế bào E.coli vào trong ống nghiệm chứa 1,7 ml mụi trƣờng LB cú bổ sung Amp (50 àg/ml), nuụi lắc qua đờm ở 370
C, 200 vũng/phỳt. - Chuyển 1,5 ml dịch nuụi cấy vào ống eppendorf loại 1,5 ml, ly tõm 6 phỳt tốc độ 7000 vũng/phỳt. Loại bỏ dịch nổi thu tế bào.
- Hũa đều tế bào thu đƣợc với 150 àl dung dịch Sol I bằng mỏy vortex, để trờn đỏ 5 phỳt.
- Bổ sung 200 àl dung dịch Sol II, đảo đầu ống eppendorf nhanh, nhẹ nhàng để trỏnh đứt gẫy DNA, ủ trờn đỏ 5 phỳt.
- Bổ sung tiếp 150 àl dung dịch Sol III và đảo nhẹ 5 lần, trong hỗn hợp sẽ xuất hiện kết tủa trắng, ủ trong đỏ 5 phỳt.
- Ly tõm 15 phỳt với tốc độ 12000 vũng/phỳt, 4 0C.
- Thu dịch nổi và chuyển sang ống eppendorf mới. Bổ sung 500 àl dung dịch phenol/chloform, trộn thật đều và ly tõm 15 phỳt, tốc độ 12000 vũng/phỳt.
- Hỳt pha trờn chuyển sang ống eppendorf và lặp lại bƣớc trờn với 450 àl hỗn hợp Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1). Bằng cỏch này lƣợng phenol cũn xút lại sẽ bị loại khỏi dung dịch DNA.
- Tủa dịch pha trờn với 2,5 lần thể tớch ethanol 100%, thờm dung dịch muối Natri acetat tới nồng độ cuối cựng là 0,3 M. Để dung dịch kết tủa ở - 200
C trong 3 giờ.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Thu DNA kết tủa bằng cỏch ly tõm 12000 vũng/phỳt trong 10 phỳt. Phần tủa DNA đƣợc rửa 2 lần với ethanol 70%, mỗi lần 1 ml và ly tõm 12000 vũng/phỳt trong 10 phỳt.
- Tủa DNA đƣợc làm khụ bằng mỏy Speed - Vac, hũa tan DNA plasmid vào 30 - 40 àl H2O cú chứa RNase nồng độ cuối cựng là 100 àg/ml, ủ hỗn hợp ở 370
C trong thời gian 30 phỳt.
- Điện di kiểm tra DNA plasmid trờn gel agarose 0,8%.
2.2.8. Tinh sạch ADN từ gel agarose bằng cột
Quy trỡnh:
- Cắt gel cho vào Eppendorf và cõn, bổ sung hai lần thể tớch đệm gắn ADN - Ủ ở 500
C trong 5 - 7 phỳt, làm tan rồi trộn đều lờn. - Bổ sung lờn cột và đợi 1 phỳt
- Ly tõm 6000 vũng /30 giõy, loại bỏ dịch ở ống dƣới
- Thờm 500àl đệm rửa (PE chứa 70% ethanol), ly tõm 6000 vũng / 30 giõy để loại bỏ dịch dƣới. Ly tõm tiếp 6000v/phỳt cho hết cồn.
- Chuyển sang Eppendorf mới và bổ sung 40μl H2O, đợi 5 phỳt. Ly tõm 13000 vũng/ phỳt thu ADN đó tinh sạch.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phõn lập Sus1 promoter từ mầm ngụ
3.1.1. Tỏch chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mầm ngụ
Mọi nghiờn cứu trờn bộ gen đều đƣợc bắt đầu từ việc tỏch chiết đƣợc DNA tổng số ở dạng tinh sạch với chất lƣợng tốt và lƣợng đủ lớn. Một trong mối quan tõm hàng đầu khi tỏch chiết DNA tổng số là thu nhận đƣợc cỏc phõn tử này ở trạng thỏi nguyờn vẹn tối đa khụng bị phõn hủy bởi cỏc nuclease nội bào. Cú rất nhiều phƣơng phỏp tỏch DNA từ nguyờn liệu thực vật, mỗi phƣơng phỏp lại cú những ƣu, nhƣợc điểm riờng phự hợp cho từng loại mụ khỏc nhau. Do mụ của mầm ngụ sử dụng trong nghiờn cứu này cú hàm lƣợng protein tƣơng đối cao, nờn chỳng tụi sử dụng proteinase K và SDS để tiến hành tỏch chiết DNA tổng số [15].
Hạt ngụ cho nẩy mầm sau đú thu mầm ngụ tỏch DNA tổng số. Để hạn chế sự phõn hủy DNA, việc tỏch chiết DNA đƣợc tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế sự hoạt động của cỏc enzyme này. Do vậy, trƣớc khi nghiền mẫu, cối và chày sứ đƣợc giữ trong tủ lạnh – 70o
C. Mẫu sau đú đƣợc nghiền trong nito lỏng. Sau khi nghiền thành dạng bột mịn. Mẫu đƣợc hũa tan trong dung dịch đệm chiết (gồm cỏc chất: SDS, Tris – HCl, EDTA, NaCl). Hỗn hợp dung dịch đệm này sẽ phỏ vỡ màng tế bào và màng nhõn, đồng thời giải phúng DNA ra mụi trƣờng. Thành phần SDS trong đệm chiết khụng những cú tỏc dụng phỏ vỡ tế bào mà cũn cú vai trũ ức chế sự hoạt động của cỏc nuclease. Trong khi đú, EDTA lại cú tỏc dụng cố định cỏc ion Mg2+ (là yếu tố cần thiết cho sự hoạt động của cỏc nuclease), nờn sẽ ngăn khụng cho cỏc nuclease phõn giải DNA trong quỏ trỡnh tỏch chiết. Việc bổ sung proteinase K cú tỏc dụng phõn hủy cỏc liờn kết peptide của protein cú trong mẫu.
Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu đƣợc bổ sung hỗn hợp phenol: chloroform : isoamyl alcohol (tỉ lệ 25 : 24 : 1). Chloroform làm tăng cƣờng hoạt động của phenol trong việc biến tớnh protein nhƣng khụng làm ảnh hƣởng đến cấu trỳc DNA, đồng thời nú cũn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tỏch pha nƣớc với chất
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
hữu cơ. Isomyl alcohol cú tỏc dụng làm giảm bọt khớ trong quỏ trỡnh tỏch chiết. Sau khi lắc mạnh và đem li tõm, hỗn hợp đƣợc phõn làm ba pha: pha trờn cựng là pha chứa nƣớc và DNA, pha giữa là protein đó bị biến tớnh, pha dƣới cựng là hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol. Pha cú chứa nƣớc và DNA đƣợc hỳt nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này sau đú đƣợc xử lý bằng hỗn hợp chloroform : isoamyl alcohol nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol cú lẫn trong dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA.
Tiếp theo là bƣớc kết tủa DNA bằng cỏch bổ sung vào dung dịch chiết CH3COONa 3M, pH 5,2 và cồn 100%. Cồn cú tỏc dụng hỳt lớp nƣớc bao quanh phõn tử DNA, để lộ ra gốc phosphate tớch điện õm. Khi đú, cỏc ion Na+ kết hợp với gốc phosphate này khiến cho lực đẩy giữa cỏc chuỗi nucleotide giảm, do đú DNA bị kết tủa. Ở điều kiện – 20oC trong 1 giờ thỡ DNA kết tủa gần nhƣ hoàn toàn. Kết tủa DNA đƣợc rửa bằng cồn 70%, sau đú làm khụ và hũa tan trong nƣớc. Trong dung dịch này cũn lẫn nhiều RNA, vỡ thể để loại bỏ RNA chỳng tụi tiến hành ủ dung dịch với RNase ở 37oC trong 2 – 3 giờ. DNA tổng số đƣợc điện di trờn gel agarose 0,8 % để kiểm tra chất lƣợng và nồng độ (hỡnh 3.1).
Hỡnh 3.1 : DNA Tổng số tỏch từ mầm ngụ 1,2,3,4,5: DNA tổng số tỏch từ mầm ngụ Q411
Chỳng tụi tiến hành PCR nhõn đoạn Sus1 promoter từ DNA tổng số của mầm ngụ. Kỹ thuật PCR đƣợc tiến hành trong mụi trƣờng đệm thớch hợp với sự xỳc tỏc của enzyme DNA pomymerase. Một yếu tố quan trọng trong thành phần của dung dịch đệm là ion Mg2+. Khi tạo thành phức với dNTP, Mg2+ cú tỏc dụng gắn dNTP với enzyme, kớch hoạt enzyme DNA polymerase, tăng sự kết hợp giữa primer
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
và đoạn khuụn. Nồng độ ion Mg2+thay đổi tựy thuộc vào quỏ trỡnh nhõn bản những đoạn DNA cụ thể. Trong thớ nghiệm này chỳng tụi sử dụng nồng độ ion Mg2+
là 10mM. Nồng độ cỏc dNTP phụ thuộc nhiều vào kớch thƣớc đoạn cần nhõn. Việc bổ sung cỏc dNTP sẽ làm giảm nhiệt độ núng chảy. Một thành phần quan trọng của PCR là cỏc đoạn primer. Việc điều chỉnh nồng độ primer cú liờn quan đến chất lƣợng sản phẩm thu đƣợc. Khi nồng độ primer cao, primer sẽ gắn khụng đặc hiệu trờn khuụn DNA và cho ra sản phẩm gồm nhiều đoạn cú kớch thƣớc khụng mong muốn. Ngƣợc lại, nồng độ primer thấp làm giảm hiệu suất phản ứng.
Đối với kỹ thuật PCR, việc thiết lập một chu trỡnh nhiệt phự hợp là yếu tố quan trọng, bởi vỡ yếu tố nhiệt đảm bảo cho sự gión xoắn của phõn tử DNA cũng nhƣ việc gắn đoạn primer và kộo dài chuỗi. Chỳng tụi tiến hành nhõn đoạn Sus1 promoter với 30 chu kỳ.
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trờn gel agarose 0,8%. Kết quả trờn (hỡnh 3.2) cho thấy sản phẩm PCR đặc hiệu. Căn cứ vào thang DNA chuẩn, kớch thƣớc của sản phẩm PCR vào khoảng xấp xỉ 1,2 kb đỳng với kớch thƣớc của đoạn gen cần nhõn .
Sản phẩm PCR này đƣợc thụi gel và tinh sạch để làm cỏc thớ nghiệm tỏch dũng. M 1 6,0 3,0 2,0 1,0 1,2 kb A
Hỡnh 3. 2 : Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn Sus1 promoter
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.1.2. Tỏch dũng đoạn Sus1 promoter trong pJET 1.2/blunt
Nhằm mục đớch tỏch dũng và xỏc định trỡnh tự đoạn Sus1 promoter, chỳng tụi đó tiến hành gắn sản phẩm PCR sau khi đó tinh sạch vào vector pJET/1.2. Sử dụng bộ húa chất GeneJET TM
PCR cloning Kit. Ƣu điểm của việc sử dụng Kit này thao tỏc đơn giản, tiện lợi, nhanh và hiệu quả cao.
Vector pJET/1.2 cú chứa điểm khởi đầu sao chộp rep (pMB1) nờn cú khả năng sao chộp độc lập với hệ gen của tế bào chủ E.coli. Gen khỏng Amp cú trờn vector cho phộp chọn lọc những tế bào cú mang vector này trờn mụi trƣờng cú Amp.
Ngoài ra, trờn vựng MCS cú chứa điểm nhận biết của cỏc enzyme giới hạn nhƣ:
XhoI, XbaI, BamHI…kế tiếp nhau giỳp dễ dàng thao tỏc lắp ghộp, thu lại và kiểm tra đoạn chốn vào. Cuối cựng, hai trỡnh tự mồi pJET/1.2 xuụi và ngƣợc nằm về hai phớa của điểm gắn sản phẩm PCR tạo điều kiện thuận lợi cho việc xỏc định trỡnh tự gen. pJET/1.2 lại là vector tỏch dũng đầu bằng nờn cỏc sản phẩm PCR đầu bằng