Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phõn lập Sus1 promoter từ mầm ngụ
3.1.1. Tỏch chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mầm ngụ
Mọi nghiờn cứu trờn bộ gen đều đƣợc bắt đầu từ việc tỏch chiết đƣợc DNA tổng số ở dạng tinh sạch với chất lƣợng tốt và lƣợng đủ lớn. Một trong mối quan tõm hàng đầu khi tỏch chiết DNA tổng số là thu nhận đƣợc cỏc phõn tử này ở trạng thỏi nguyờn vẹn tối đa khụng bị phõn hủy bởi cỏc nuclease nội bào. Cú rất nhiều phƣơng phỏp tỏch DNA từ nguyờn liệu thực vật, mỗi phƣơng phỏp lại cú những ƣu, nhƣợc điểm riờng phự hợp cho từng loại mụ khỏc nhau. Do mụ của mầm ngụ sử dụng trong nghiờn cứu này cú hàm lƣợng protein tƣơng đối cao, nờn chỳng tụi sử dụng proteinase K và SDS để tiến hành tỏch chiết DNA tổng số [15].
Hạt ngụ cho nẩy mầm sau đú thu mầm ngụ tỏch DNA tổng số. Để hạn chế sự phõn hủy DNA, việc tỏch chiết DNA đƣợc tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế sự hoạt động của cỏc enzyme này. Do vậy, trƣớc khi nghiền mẫu, cối và chày sứ đƣợc giữ trong tủ lạnh – 70o
C. Mẫu sau đú đƣợc nghiền trong nito lỏng. Sau khi nghiền thành dạng bột mịn. Mẫu đƣợc hũa tan trong dung dịch đệm chiết (gồm cỏc chất: SDS, Tris – HCl, EDTA, NaCl). Hỗn hợp dung dịch đệm này sẽ phỏ vỡ màng tế bào và màng nhõn, đồng thời giải phúng DNA ra mụi trƣờng. Thành phần SDS trong đệm chiết khụng những cú tỏc dụng phỏ vỡ tế bào mà cũn cú vai trũ ức chế sự hoạt động của cỏc nuclease. Trong khi đú, EDTA lại cú tỏc dụng cố định cỏc ion Mg2+ (là yếu tố cần thiết cho sự hoạt động của cỏc nuclease), nờn sẽ ngăn khụng cho cỏc nuclease phõn giải DNA trong quỏ trỡnh tỏch chiết. Việc bổ sung proteinase K cú tỏc dụng phõn hủy cỏc liờn kết peptide của protein cú trong mẫu.
Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu đƣợc bổ sung hỗn hợp phenol: chloroform : isoamyl alcohol (tỉ lệ 25 : 24 : 1). Chloroform làm tăng cƣờng hoạt động của phenol trong việc biến tớnh protein nhƣng khụng làm ảnh hƣởng đến cấu trỳc DNA, đồng thời nú cũn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tỏch pha nƣớc với chất
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
hữu cơ. Isomyl alcohol cú tỏc dụng làm giảm bọt khớ trong quỏ trỡnh tỏch chiết. Sau khi lắc mạnh và đem li tõm, hỗn hợp đƣợc phõn làm ba pha: pha trờn cựng là pha chứa nƣớc và DNA, pha giữa là protein đó bị biến tớnh, pha dƣới cựng là hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol. Pha cú chứa nƣớc và DNA đƣợc hỳt nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này sau đú đƣợc xử lý bằng hỗn hợp chloroform : isoamyl alcohol nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol cú lẫn trong dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA.
Tiếp theo là bƣớc kết tủa DNA bằng cỏch bổ sung vào dung dịch chiết CH3COONa 3M, pH 5,2 và cồn 100%. Cồn cú tỏc dụng hỳt lớp nƣớc bao quanh phõn tử DNA, để lộ ra gốc phosphate tớch điện õm. Khi đú, cỏc ion Na+ kết hợp với gốc phosphate này khiến cho lực đẩy giữa cỏc chuỗi nucleotide giảm, do đú DNA bị kết tủa. Ở điều kiện – 20oC trong 1 giờ thỡ DNA kết tủa gần nhƣ hoàn toàn. Kết tủa DNA đƣợc rửa bằng cồn 70%, sau đú làm khụ và hũa tan trong nƣớc. Trong dung dịch này cũn lẫn nhiều RNA, vỡ thể để loại bỏ RNA chỳng tụi tiến hành ủ dung dịch với RNase ở 37oC trong 2 – 3 giờ. DNA tổng số đƣợc điện di trờn gel agarose 0,8 % để kiểm tra chất lƣợng và nồng độ (hỡnh 3.1).
Hỡnh 3.1 : DNA Tổng số tỏch từ mầm ngụ 1,2,3,4,5: DNA tổng số tỏch từ mầm ngụ Q411
Chỳng tụi tiến hành PCR nhõn đoạn Sus1 promoter từ DNA tổng số của mầm ngụ. Kỹ thuật PCR đƣợc tiến hành trong mụi trƣờng đệm thớch hợp với sự xỳc tỏc của enzyme DNA pomymerase. Một yếu tố quan trọng trong thành phần của dung dịch đệm là ion Mg2+. Khi tạo thành phức với dNTP, Mg2+ cú tỏc dụng gắn dNTP với enzyme, kớch hoạt enzyme DNA polymerase, tăng sự kết hợp giữa primer
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
và đoạn khuụn. Nồng độ ion Mg2+thay đổi tựy thuộc vào quỏ trỡnh nhõn bản những đoạn DNA cụ thể. Trong thớ nghiệm này chỳng tụi sử dụng nồng độ ion Mg2+
là 10mM. Nồng độ cỏc dNTP phụ thuộc nhiều vào kớch thƣớc đoạn cần nhõn. Việc bổ sung cỏc dNTP sẽ làm giảm nhiệt độ núng chảy. Một thành phần quan trọng của PCR là cỏc đoạn primer. Việc điều chỉnh nồng độ primer cú liờn quan đến chất lƣợng sản phẩm thu đƣợc. Khi nồng độ primer cao, primer sẽ gắn khụng đặc hiệu trờn khuụn DNA và cho ra sản phẩm gồm nhiều đoạn cú kớch thƣớc khụng mong muốn. Ngƣợc lại, nồng độ primer thấp làm giảm hiệu suất phản ứng.
Đối với kỹ thuật PCR, việc thiết lập một chu trỡnh nhiệt phự hợp là yếu tố quan trọng, bởi vỡ yếu tố nhiệt đảm bảo cho sự gión xoắn của phõn tử DNA cũng nhƣ việc gắn đoạn primer và kộo dài chuỗi. Chỳng tụi tiến hành nhõn đoạn Sus1 promoter với 30 chu kỳ.
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trờn gel agarose 0,8%. Kết quả trờn (hỡnh 3.2) cho thấy sản phẩm PCR đặc hiệu. Căn cứ vào thang DNA chuẩn, kớch thƣớc của sản phẩm PCR vào khoảng xấp xỉ 1,2 kb đỳng với kớch thƣớc của đoạn gen cần nhõn .
Sản phẩm PCR này đƣợc thụi gel và tinh sạch để làm cỏc thớ nghiệm tỏch dũng. M 1 6,0 3,0 2,0 1,0 1,2 kb A
Hỡnh 3. 2 : Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn Sus1 promoter
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn